DNA怎样修复？非同源重组连接途径（NHEJ）精确制导

近年来，随着核酸酶介导的靶向基因组编辑技术迅速发展，CRISPR/Cas9基因编辑系统可以使基因组DNA双链断裂（Double-strand breaks, DSBs），从而进行DNA修复，修复途径主要包括非同源末端连接修复（Non-homologous end-joining, NHEJ）和同源重组修复（Homologous recombination,HR）两种，但是还存在有其它的非同源重组修复途径，例如微同源末端连接（MMEJ，Microhomology-mediatedend joining）和单链退火途径（Single-strand annealing SSA）（图1）。

图1 非同源修复的三种途径(McVeyM et al.;2008)

绿色方框代表需要识别的同源序列

近日，美国马萨诸塞大学医学院的Scot A. Wolfe团队和Charles P. Emerson Jr团队合作在Nature在线发表了一篇题为'Precise therapeutic gene correction by a simple nuclease-induced double-stranded break'的文章，描述了一种基于微同源末端连接（MMEJ）的修复途径对基因组上致病性微重复中心附近区域进行修复编辑，修正肢带型肌营养不良2G型(limb-girdle muscular dystrophy type 2G,LGMD2G)和白化病亚型Hermansky-Pudlak综合征1型(Hermansky–Pudlaksyndrome type 1,HPS1)的基因序列，实现了精确恢复野生型基因序列的目的（图2），同时评估了基于MMEJ修复方式的有效性。

图2 致病性8-bp微重复TCAP(粗体红色和蓝色文本)。红色框内为SpCas9PAM序列，下划线为sgRNA.红色箭头表明CRISPR/Cas9诱导的DSB的位点，半红半蓝文本为修复后的野生型序列。

鉴于此文：NHEJ的这三种方式有什么的区别？它的修复原理是否已经阐明?下面来简单介绍一下这几种修复方式的区别及NHEJ修复机制的过程。

NHEJ途径修复DSB损伤是通过末端直接相连的方式进行的，这种连接不需要大片段的同源序列识别，而只需要1-5bp的碱基配对就可以进行修复，属于一种易错修复。2016年，阿姆斯特丹自由大学的Erwin Peterman和Gijs Wuite在Nature发表的文章”Sliding sleeves of XRCC4–XLF bridge DNA and connect fragments of broken DNA”阐述了NHEJ修复的机制，弄清了NHEJ是如何修复双链DNA断裂的，发现NHEJ在修复过程中的两种蛋白质（XLF和XRCC4）可以捕获断裂双链DNA的损伤末端，并将它们结合在一个高度稳定，但却可以移动的复合物中，就像带粘性的“袖子”，覆盖并沿DNA两端滑动，这两个蛋白参与将两个断裂的DNA末端集合在一起（图3）。

图3 XRCC4(绿色)和XLF(红色)在DSB后桥接和结合DNA片段(灰色)的机制。

      同年，中国科学院高彩霞研究组和李家洋研究组在利用CRISPR/Cas9系统NHEJ修复机制于水稻基因进行定点替换及插入，利用建立的基因定点替换和定点插入两种策略，实现了水稻内源OsEPSPS基因保守区两个氨基酸的定点替换，相关成果'Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR–Cas9'发表在Nature Plants上(图4)。

图4 利用CRISPR/Cas9技术通过碱基替换策略获得草甘膦抗性的水稻材料

与NHEJ修复途径比较，MMEJ修复与其最大的差别在于所识别的同源序列长度的不同，MMEJ修复途径需要5-25个碱基同源序列(图1，图2a)。常常会造成连接处发生同源片段的缺失或者基因重排，也是一种易错的修复方式。因此，尽管MMEJ在修复模式上类似于NHEJ,但仍然是一种完全独立的NHEJ途径的修复模式。

与NHEJ和MMEJ途径相比较，SSA途径需要更长的同源序列(>30bp)来进行识别，其类似于MMEJ途径的是，SSA途径可以导致基因组的缺失；此外，SSA与同源重组途径类似，也被归属为同源序列依赖型的DSB修复模式，两者都需要通过5’到3’的DNA剪切，产生3’突出的单链ＤＮＡ。2018年6月，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴实验室与华中农业赵云德教授实验室合作的题为“Synthesis-dependent repair of Cpf1-induced double-strand DNA breaks enables targeted gene replacement in rice”的研究论文，就是利用合成依赖性修复机制在水稻中实现了ALS基因的等位基因替换，获得了抗除草剂水稻(图5)。

图5 利用合成依赖性修复机制实现ALS基因的等位基因替换

同样，这三种修复方式在动植物中也实现了定向插入外源性供体DNA或者基因碱基的替换，在这里就不一一进行介绍了，随着科学技术的进步，不论是同源修复途径还是非同源修复途径，在未来必将会成为治疗疾病，改良性状等有效的技术手段。