结果-1 KRAS*突变在CRC进展中显著抑制免疫微环境
KRAS*突变通过增加MDSCs、减少T细胞浸润来促进晚期CRC的免疫抑制微环境：
FlowJo分析显示，与iAP肿瘤相比，iKAP（KRAS*）肿瘤中的T细胞比例明显下降，尤其是CD4+细胞，相反，iKAP肿瘤中骨髓源性抑制细胞(MDSCs)，尤其是多形核MDSCs (PMNMDSCs)显著增加（Fig.1B）。
KRAS*-off (Dof-off)状态的肿瘤MDSCs减少，T细胞增多（Fig.1C）。
IHC染色显示，KRAS*突变驱动的肿瘤明显缺乏T细胞浸润，相反具有显著的MDSC（Gr-1、S100A8、S100A9）浸润（Fig.1D）。
从iKAP肿瘤中分离的MDSCs能够显著抑制T细胞的增殖（Fig.1EFG）。
结果-2 KRAS*抑制CRC中的干扰素反应
IPA分析显示，KRAS*肿瘤以下调干扰素IFN-g和IFN-a反应为主要途径（Fig.2A）。对KRAS*肿瘤细胞系IPA分析表明，IFN-g和IFN-a信号是与KRAS*表达最相关的通路之一（Fig.2B）。
与Krsa野生型相比，IFN反应基因在KRAS*(Dox-on)驱动的细胞中表达量显著减少（Fig.2C）。
维恩图三维数据集分析：(i) IFN-a和IFN-g标记基因(n = 223)；(ii)差异表达、侵袭性和非侵袭性基因(n = 5727)；(iii)与KRAS突变相互排斥的基因(n = 56)，挑出唯一满足条件的基因——干扰素调节因子（IRF2）（Fig.2D）。
对TCGA CRC数据库中KRAS和IRF2的基因组进一步分析显示，IRF2缺失与KRAS突变是相互排斥的（Fig.2E）。
结果-3 KRAS*通过抑制IRF2来介导IFN反应
IRF2是KRAS*介导的IFN网络抑制的主要调控因子：
KRAS*（GFP+）突变的iKAP细胞显示具有低表达的IRF2（Fig.3A）。对KRAS*灭活48h和1w后，IRF2表达显著增加（Fig.3B）。
与iKAP细胞相比，对IRF2过表达的iKAP细胞进行IPA分析，结果显示IFN-a/g信号表达上调（Fig.3C），包括：IFN信号分子(STAT1, STAT2, IRF9, IRF7)，参与宿主防御相关免疫调控因子(RTP4, IFITM1, IFIH1, IFI44, PARP14, NMI, SAMD9L)，抗原表达(PSMB9, PSMB10, B2M)，细胞死亡因子(CASP7, CASP1)（Fig.3D）。
iKAP细胞的ChIP-seq显示了IRF2与IFN反应基因启动子的结合峰（Fig.3E）。
结果-4 IRF2通过CXCL3/CXCR2轴来抑制KRAS*驱动的MDSC迁移
KRAS*灭活（Dox-off）和IRF2过表达的培养基中观察到MDSC迁移减少（Fig.4A）。MC38 CRC细胞株（Kras wild-type）沉默IRF2(shIRF2)（Fig.4B），显著增加了MDSCs向体外条件培养基的迁移（Fig.4C），同时增加了MC38肿瘤移植C57BL/6J小鼠中MDSCs的浸润（Fig.4D）。综上，这些数据表明，抑制IRF2是KRAS* CRC中MDSC积累迁移的关键中介因子。
ChIP-seq显示iKAP细胞中IRF2在CXCL3基因座的结合峰，CXCL3在其启动子中含有IRF2-结合元件，增强了IRF2过表达的结合（Fig. 4E.4F）。
当IRF2表达增强或KRAS*灭活后，CXCL3的表达和分泌被显著抑制。（Fig. 4G.4H）。
免疫荧光染色显示，iKAP肿瘤中CXCR2的表达与Gr-1(MDSC)共定位，表明了CXCL 3/CXCR 2轴在形成晚期CRC免疫微环境中的潜在作用（Fig. 4I）。在培养基中加入重组小鼠CXCL3蛋白增加了MDSC的迁移（Fig. 4J）。相反，加入CXCR2抑制剂SX-682或抗CXCL3中和抗体后MDSC迁移率降低（Fig. 4K）。
在30天的Sx-682剂量治疗中，KRAS*表达的CRC肿瘤显著减少了MDSC，增加了T细胞浸润（Fig.4L.4M），导致肿瘤细胞死亡（Fig.4N）。
结果-5 IRF2过表达增强了KRAS* CRC细胞对抗PD-1治疗的敏感性
利用western blot分别验证了IRF2和p-ERK在MC38（KRAS-wild type）、MC38K（KRAS*）和MC38KI (KRAS*/IRF2)细胞株中的表达情况（Fig.5A）。与iKAP模型一致， MC38K抑制了代表性IFN反应基因，并在MC38KI细胞中恢复（Fig.5B）。值得注意的是，MC38KI细胞显示了CXCL3和MDSC（CD45+）的低表达（Fig.5B.5C）。
MC38K肿瘤的生长速度略快于MC38对照组，而MC38KI与MC38和MC38K相比，肿瘤生长明显减慢（Fig.5D）。从这些肿瘤生长发现，MC38KI与小鼠的存活率改善密切相关，抗PD-1的抗肿瘤活性在KRAS*表达过程中受到损害，而在KRAS*/ IRF 2同时表达的过程中恢复（Fig.5E）。提示IRF2的表达是保持CRC抗PD-1敏感性的关键决定因素。
结果-6 CXCR2的抑制增强了KRAS* CRC细胞对抗PD-1治疗的敏感性
结果-7 IRF2表达可以预测CRC抗PD-1治疗的反应
对CRC的TCGA数据集进行基因集富集分析(GSEA)显示，在KRAS*突变的CRC中，IFN-g和IFN-a信号是最受抑制的通路（Fig.7A）。相反，IFN-g信号是IRF2-high CRC中最活跃的信号通路之一（Fig.7B）。
利用IHC进一步显示了IRF2表达与KRAS突变状态的关系，有64%的KRAS野生型样本可检测到IRF2的表达，而在KRAS突变型样本中，只有30%可检查到IRF2的表达（Fig.7C）。
IRF2表达与抗PD-1治疗在MSI-H CRC中的相关性分析显示(n=14)，较高的IRF2表达与更好的抗PD -1治疗反应呈正相关（Fig.7D）。
Fig.7E阐释了KRAS/IRF2轴在CRC免疫抑制和ICB耐药的作用原理。
