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2019年4月11日，新英格兰医学在线发表了一篇题为“Glutaminase Deficiency Caused by Short Tandem Repeat Expansion in GLS”的文章，再次聚焦由编码谷氨酰胺酶(GLS)基因5’非翻译区的GCA重复序列的STR扩增引起的遗传性代谢缺陷病。 近年来，关于STR与疾病及癌症的关联机制研究屡发好文，2018年4月，PNAS发表了微卫星扩增诱导了内含子的保留可以作为疾病生物标志物的文章（【昊阅读】微卫星扩增诱导内含子保留可以作为疾病生物标志物）。6月，天昊基因科技（苏州）有限公司与浙江大学医学院附属第二医院（浙医二院）神经内科罗巍教授合作，发表于国际临床神经病学及神经科学顶级期刊Brain的文章 “Intronic pentanucleotide TTTCA repeat insertion in the SAMD12 gene causes familial cortical myoclonic tremor with epilepsy type 1”，首次报道了中国人群SAMD12基因内含子区五核苷酸（TTTCA）重复插入导致家族性皮层肌阵挛性震颤癫痫1型（【昊文章】天昊基因与浙医二院合作发现SAMD12基因内含子区五核苷酸（TTTCA）重复插入导致家族性皮层肌阵挛性震颤癫痫1型）。9月，Cell杂志又以Article形式报道了重量级研究成果，发现疾病相关短串联重复序列（STR）与染色质结构域边界之间密切相关（Cell重磅：疾病相关短串联重复序列（STR）与染色质结构域边界共定位）。此外，关于微卫星不稳定性MSI与癌症关系的文章也有大量报道（《科学》《自然·医学》2017年度科学进展都有它，MSI检测成癌症治疗热点）。 回到NEJM这篇文章，本研究通过详细的临床和生化表型分析，利用全基因组测序，在三名无关患者中观察到了这种STR扩增现象，他们表现为早发性整体发育迟缓、进行性共济失调和谷氨酰胺水平升高。除了共济失调，有一名患者还存在小脑萎缩症状。这种扩增与其转录的GLS mRNA相对缺乏有关，这可能是位于GLS重复序列上游，由重复序列介导的染色质改变造成的。  三名不相关的患者均出生于欧洲血统，父母为白人，无妊娠和分娩后并发症，年龄分别为3岁（1号和2号患者来自英国）和2岁（3号患者来自加拿大），在粗大运动技能和精细运动技能方面均出现早发性迟缓，以及言语障碍。早期大脑成像没有显示异常，在11岁时，在核磁共振成像中发现患者3患有小脑萎缩。 测序和基因组分析 从外周血中分离基因组DNA，在从家系1和3获得的样本中进行母亲、父亲和先证者的外显子组测序，而从家系2获得的样本进行母亲和先证者的外显子组测序。此外，对从家系1中的先证者获得的样品进行全基因组测序。经过对测序数据的分析，以及一代测序确认了错义和移码变体，通过重复引物PCR（或称三引物PCR）和GLS重复PCR确认STR扩增的存在。 生物化学分析 在含有谷氨酰胺反应混合物中测定成纤维细胞和外周血单核细胞中的GLS活性，利用分光光度法测定。 功能实验 研究者进行了染色质分析、焦磷酸测序并将GLS启动子克隆到荧光素酶报告载体中，以研究重复扩增对转录和翻译的影响。对从患者获得的样本进行酶促分析、免疫印迹、互补及晶体结构等功能分析。 代谢发现 对三名患者进行代谢评估发现，尽管血浆氨水平正常，但血浆谷氨酰胺超过正常范围(405至781μmol/L)的上限2.5倍。三名患者的父母和兄弟姐妹血浆谷氨酰胺水平在正常范围内。 外显子组测序 研究使用临床基因检测Panel排除了尿素循环障碍。基于这些患者可能存在新的遗传性代谢缺陷的假设，研究者对家系1(先证者和双亲)和家系2(先证者和单亲)进行了外显子组测序和分析，并且独立分析了家系3 (先证者和双亲)的数据。结果未鉴定出任何主要的候选基因。然后我们评估家系1和家系2中先证者的外显子组测序结果，罕见杂合子状态的有害变异分别在345和320个基因中被鉴定到，其中24和29个与人类智力障碍或脑病有关，特别的关注到了编码谷氨酰胺酶的GLS中的父系遗传变体c.938C→T(p.Pro313Leu；NM_014905)。在家系2中，研究者没有发现符合临床或生化表型的候选变异。在另一项研究中，外显子组分析揭示了患者3中一个GLS母系遗传杂合变体c.923dupA (p.Tyr308*；NM_014905) (图1A)。在患者1和患者3中发现的错义和移码GLS变异，都被预测为具有破坏性。
生化表型 外显子组结果提示了GLS缺乏症，但不是结论性的，因此研究者进行了进一步的生化表型分析。淋巴细胞和成纤维细胞的功能分析显示，所有三名患者的GLS活性明显降低(图2A)。免疫印迹分析显示，从所有三名患者获得的成纤维细胞中谷氨酰胺酶水平降低，而患者2的淋巴细胞中实际上没有谷氨酰胺酶(图2B)。重组表达的突变体GLS显示出2.8%的残留酶活性，而重组表达的p.Tyr308*变体没有检测到活性(图2C)。功能分析方面，稳定同位素标记的谷氨酰胺、葡萄糖和油酸盐用于原位分析GLS缺乏症及其代谢。在从所有三名患者获得的样本中，均观察到与同位素标记的谷氨酰胺一起孵育的成纤维细胞中同位素标记的谷氨酸盐水平显著降低，这一发现表明GLS活性是一致的(图2D)。 图2、GLS缺乏症的生化特征鉴定 基因组测序 生化分析表明患者存在GLS缺乏症，但是外显子组测序结果不能完全从遗传学角度进行解释。因此，研究者对患者1的基因组进行了测序。对GLS周围顺式调节区的手工分析揭示了在GLS 5’非翻译区存在一个GCA重复。利用基因组序列扩增检测工具Expansion Hunter，研究者鉴定出一个染色体上由90多个GCAs组成的三重复扩增，该扩增是先证者从母亲遗传来的。父亲遗传的等位基因有八个GCA拷贝(图1A)。 三核苷酸重复分析 针对STR的GCA重复区域，研究者利用重复引物PCR和GLS重复PCR进行了确认。重复引物PCR检测，引物与一段GCA重复序列互补，表明所有三名患者都有较大的GCA重复扩增，他们的一个或两个父母也是如此(图1B)。使用GCA重复旁侧引物的重复PCR反应分析显示，在从三个先证者获得的血液样品中，分别有大约680、900和1500个重复的主要扩增产物(图1C)。在家系1、2和3先证者的成纤维细胞中检测到少量三核苷酸重复(400至1100)的扩增，这与许多其他重复扩增障碍所报告的体细胞异质性一致。 在由8295个个体基因组组成的普通人群集合中对该GCA重复扩增位点的分析表明，该短串联重复具有14个重复的中值大小(即42 bp)和8个和16个重复的双峰比率。在所分析的8295个基因组中，1个是具有90个以上重复的等位基因的杂合子 (图1D)。 重复介导的效应 为了研究与抑制GLS表达的三核苷酸重复扩增一致的等位基因表达不平衡效应，研究者对从血细胞中纯化的DNA(三核苷酸重复扩增的上游和下游)进行焦磷酸测序，在从任何患者获得的样品中没有发现DNA甲基化增加的证据(图3A)。当基因组DNA被甲基化敏感的限制性内切酶处理时，几乎所有GLS PCR产物的损失证实了患者成纤维细胞中甲基化的缺失。 进行ChIP-qPCR实验以确定扩增是否影响相邻GLS启动子的组蛋白修饰。患者的等位基因检测显示组蛋白修饰转录活性区(H3乙酰化和 H3K4me3)的修饰水平降低，而一些转录沉默区(H3K9me3)的组蛋白修饰得到富集(图3B)。这种效应在携带两个扩增重复等位基因的患者2中更明显。这些数据表明，重复扩增导致染色质构型改变，从而导致转录减少。 为了检测扩增重复对转录起始和延伸或翻译的影响，研究者将含有13个、104个和240个GCA重复的GLS启动子的DNA片段克隆到荧光素酶报告载体中。空白载体(pGL3.1)和含有13个重复的载体的比较证实了，在基线时和对谷氨酰胺补充的响应中强GLS启动子活性(图3C)。综上所述，实验数据表明重复扩增的主要作用是改变组蛋白修饰水平，通过促进对异染色质的形成，减少GLS转录，进而导致谷氨酰胺酶缺乏。 图3、重复介导效应机制 1、本研究描述了由三核苷酸STR GCA重复扩增引起的遗传性代谢缺陷的鉴定。 2、本研究强调了检测基因组非编码区的重要性。 |
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