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细胞，怎么说呢？到现在我依然得第一次到细胞房的情形，第一天进入实验室，是没有操作的资格的，只能在旁边看着，师傅让我在显微镜里初略的看了一眼，其实我没有看太清楚，也不确定自己看到的是不是，但看师傅实在忙也不好意思开口多问，只嗯了一声。在他们实验的空档，其他实验员跟我聊了起来，其中让我印象最深的一句话是“下周我可以先给你一盘细胞养养看，我对它的了解就像农民伯伯了解大粪一样，你放心，肯定能教你养好，一个细胞养好了，其他的也就能融会贯通了” 做好细胞实验的基础，就是养好细胞，同事的那句话，话虽糙，但理却确实是这么个理。细胞跟人其实是一样一样的，人有高矮胖瘦，脾气秉性不尽相同，细胞也是如此，他们的形态，包括圆形、梭形、杆状、星形、多边形或是其他不规则形状，主要“食物”是DMEM跟1640，就跟我们人类的米饭跟面食一样，也有其他一些不太常规的，比如F12、L15、McCoy's 5A等，一般情况下（特定的实验目的，需要进行细胞驯化的除外），不建议更换培养基品类，就像你让上海小姑娘到重庆吃朝天辣火锅一样，它也要受不了的。除了保证日常的温饱，还要给予一定的关注度，每天观测细胞的时候看的仔细一点，增殖速率，细胞状态等等，实验记录一定要注意细节，尤其是那些经过了“手术”的：转染、侵染后的效率及细胞毒性；药筛后的存活率；改造后细胞的形态、品性等等，待你跟它熟了，对它的脾气秉性了解了，把它养的“白白胖胖”的，它自然也能配合好你后续的实验。 首先说的是增殖及周期实验，这两个放在一起，主要是因为实验的关键点都是细胞的生长周期。增殖实验细胞铺板的时候要根据细胞的增长速率，严格把握好铺板密度，尽量保证所有检测时间点都能够在细胞的指数增长期完成，否则因为生长空间的限制后面的时间点可能都没有参考价值，生长周期太短也可考虑适当的降低所有实验组的血清浓度，如对细胞生长周期把握不是很大的话，可以考虑先做预实验，检测第一个时间点及最后一个时间点即可。细胞的周期实验比较清晰，常规传代后24或48h安排检测即可，但也有异常的可能检测不到S期，这就需要对细胞生长周期再严格的监测一下，提前或延后检测时间点。有些同学在固定的时候也会出些问题，固定完了之后细胞黏连，或者出现吹不散的细胞团块，堵机子。首先细胞黏连，第一考虑的是消化的时候，时间过长，直接导致细胞黏连，这个问题出在固定之前，那么就要求细胞消化的时间把握好，比常规传代的时候更精确一些，显微镜下看到细胞变圆即可处理；第二就是离心过程，离心后需将上清尽量吸弃，最好能用PBS再重悬洗涤一次。细胞结团一般是固定的时候细胞没有打散，不论是直接加预配好的固定液，还是先加PBS再加乙醇的方式，都需要将细胞轻轻打散。这样基本可以顺利完成上述两项实验。 ■ ■■■■ 侵袭及迁移实验，是关于细胞的转移及迁移能力的。侵袭目前一般都是用transwell小室，可以用买包被好的小室，也可以自己包被，这个一般没有太大问题。侵袭一般先将细胞饥饿一段时间，正式实验的时候，上下室需要有血清浓度差。如果你的参考文献及MMP等基因检测都指向该细胞可以过膜而你的实验没有过的话，考虑：一是细胞状态，状态差的话过膜能力也会差；二，下室的趋化因子不够，血清浓度在允许范围内再进行调整，或者加入条件培养基（即以正常细胞培养24后上清液与普通完培以一定比例混合）；三，细胞可能已经过膜了，落在了下室，请微调一下你的显微镜，如是，可将实验时间点提前；四，是否因为细胞过大，需要更换更大孔径的小室（常规用8um）；五，也是所有人最不愿意遇到的，你用的可能是个假细胞，赶紧去做下STR鉴定吧。迁移实验一般有两种方式，划痕及transwell，transwell同上，只是不需要包被matrigel胶，问题的解决方案基本同上，其中只有一个注意点，因为没有铺胶，8um的小孔在那，一般4-6小时后，上下室的血清浓度会达到平衡，建议，如果可以中途再补充一下血清。迁移实验的另外一种方法是划痕，划痕主要也是掌握细胞的生长周期，在细胞完全愈合之前完成所有时间点的监测，另外把握好降低的血清浓度，尽量真实反映细胞的迁移能力，而不是增殖能力。 ■ ■■■■ 凋亡及其他涉及FACS检测的。FACS相关检测，染料的选择要结合细胞的具体情况，如本身没有带荧光则可以自由选择，如本身带有荧光，请避开相关的荧光波段，如果实在没有办法避开，需要设置一个调补偿组，正式实验前将荧光补偿调整好。多个指标检测的，尤其要分清干扰波段。凋亡实验，收取样品的时候一定要收集上清里的细胞，里面包括了凋亡及死亡的细胞，是整体实验数据里的一部分，消化的时候选用不含EDTA的胰酶，消除假阳性。当然凋亡还有其他检测手法，如tunel或是DNA ladder等，这两者，一般晚期凋亡多的话检测结果会比较明显，实验尤记得设好阳性参照。 ■ ■■■■ 另外还有免疫荧光、免疫组化等等，这些可以细胞先做好爬片，也可以直接在孔板里做（孔板里做的话洗脱的时候需要小心，细胞容易漂），免疫相关的细胞固定及通透不能少，一抗孵育需充分，如过夜第二天取出的时候也可以在37度再放一会，二抗孵育及免疫组化后期的显色时，阴性对照及阳性对照必不可少，时间长了会有假阳性，短了会有阴性。 ■ ■■■■ 以上，细胞相关的实验还有许多许多，我接触的可能也只是简单的一小部分，且做且珍惜，也希望在我历走人间的岁月里，多经历它们更多不一样的“人生”。 |
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