前几天有人在后台留言,说是PCR出现了问题,嗯,没有条带,电泳后,产生了大量弥散带…… 究竟是PCR的退火温度不对,还是反应体系的设计出了问题?究竟是模板的问题,亦或是引物设计出了纰漏? 实际上,嗯,是吃了文化的亏。要是英语学好了,就不会有这种困惑了…… 好吧,其实一般我们都会在实验室里遇到这样或者那样的问题,那到哪里去问呢?要是师兄师姐不给力的话,只能去查了。 文化程度比较高的,英文水平比较好的童鞋们,就可以上下面这个网站去查: 这其实就是Research Gate……一个做实验的人必备的网站,包括下载文献之类的功能都有,包括大量的实验问题,都能在这里解决。只是,全英文而已…… 于是我搜了一下“Smear PCR”,然后就发现: 有一百多个人都提过差不多的问题,随便挑两个哈: 还有这样的: 当然,我们总结一下,到底为什么PCR会产生这样的非特异性的弥散带哈: 1)模板量过多,在电泳时会形成弥散状;(一般不会有这么大量吧) 2)模板量过多,使得引物无法精准地结合到目的片段上,导致非特异性扩增增加;(不要一味地觉得模板越多扩增越好) 3)退火温度低,导致了非特异性扩增;(你们自己设计引物,自己知道哦) 4)循环次数过长,导致dNTP耗尽,产物聚合;(这个应该不常见,都用2×Mix了) 5)延伸时间太短,导致目的片段无法延伸出来,产物就自然产生弥散了;(就是人家要长20秒,你不能10秒就拔苗助长) 6)用热启动的话会降低弥散可能性;(就是买贵点的Mix) 7)模板断裂,可能会导致这样的情况;(特别是RNA的抽提,以及cDNA合成的过程中需要注意) 8)你用的2×Mix不太行;(这倒是有可能哈) 9)PCR仪坏了;(这得有多高难度把PCR都弄坏了呢) 10)电泳的凝胶没做好。(这一般会导致Marker也弥散) PCR是不难,难的是解决问的能力,其实遇到问题也并不复杂,只要懂得去查就行了。回复“公克”(不要在评论区回复)就给你这个网址吧,不用翻墙的,祝你们心明眼亮。 |
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