文章来源：中华神经科杂志, 2018,51(6) : 419-424 作者：李楠 赵哲 沈宏锐 邴琪 郭璇 胡静
摘要 目的 回顾性分析经分子生物学诊断的6例胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者的临床、病理、基因变异特点，提高对胶原Ⅵ蛋白相关肌病的认识。 方法 对2010—2017年间于我科住院的患者，经外周血或冰冻骨骼肌组织行二代测序后筛选胶原Ⅵ蛋白相关肌病6例，收集患者临床资料、骨骼肌活体组织检查结果等。 结果 6例患者均为幼儿期起病，起病年龄(2.00±0.75)岁，出生后存在运动发育迟缓；6例均表现为四肢近端肌无力，1例伴远端肌无力；3例伴骨关节病变；1例重度皮肤瘢痕。血清肌酸激酶187～380 U/L，呈轻度升高。肌电图3例均呈肌源性改变，2例轻度神经源性改变，1例为肌源性合并神经源性改变。二代测序基因检测结果发现4例COL6A1基因杂合突变(3例为已报，1例新发)、1例COL6A2基因新发杂合突变、1例COL6A1和COL6A2新发复合杂合突变。骨骼肌活体组织检查病理分析示：肌纤维大小不一、结缔组织增生明显，散在不透光肌纤维；6例均经抗胶原Ⅵ、Ⅳ蛋白单克隆抗体免疫荧光双染，肌纤维膜胶原Ⅵ蛋白表达均呈不同程度缺失。 结论 胶原Ⅵ蛋白相关肌病具有高度临床异质性，骨骼肌活体组织检查病理分析缺少特异性，抗胶原Ⅵ、Ⅳ单克隆抗体免疫荧光双染可见胶原Ⅵ蛋白部分或完全缺失。二代测序基因分析对于诊断临床中间型胶原Ⅵ蛋白相关肌病具有重要价值。 胶原Ⅵ蛋白是主要细胞外基质蛋白之一，广泛分布在骨骼、肌肉、角膜、皮肤等组织细胞外基质。分布在骨骼肌细胞的基底膜胶原Ⅵ蛋白与细胞膜紧密结合形成微纤维网，与其他基质蛋白、细胞跨膜受体相互作用将肌细胞基底膜锚定于周围结缔组织。胶原Ⅵ蛋白相关肌病的遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传(AR)以及散发型，目前报道的AR仅见于COL6A1和COL6A2基因[1,2,3,4]。胶原Ⅵ蛋白由COL6A1、COL6A2和COL6A3基因编码的α1、α2、α3三条多肽链以三螺旋结构组成，属于单倍体－双倍体－四倍体结构。由于编码三条肽链的基因发生了致病突变，导致胶原Ⅵ蛋白结构和(或)功能的异常，患者临床上出现了相关的肌肉、骨关节、皮肤等多系统受累。因该病以骨骼肌受累最为显著，故统称为胶原Ⅵ蛋白相关肌病(collagen type Ⅵ related myopathies)，临床表型包括Ullrich型先天性肌营养不良、中间型Ⅵ型胶原蛋白病和Bethlem肌病、肌硬化症等。鉴于本组疾病临床谱系复杂，我们对我科经基因检测确诊的胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者进行了回顾性分析，总结其临床、病理、分子生物学特点，以提升临床医生对胶原Ⅵ蛋白相关肌病的认识。资料和方法 一、研究对象 本研究为回顾性研究。收集2010—2017年于河北医科大学第三医院住院的患者中以肌无力就诊，存在关节挛缩或关节过伸展，通过血肌酸激酶、肌电图等检查初步诊断为先天性肌病或肌营养不良，经骨骼肌活体组织检查(活检)可除外代谢性、部分先天性肌病(胞质内存在特异形态学表现)等的患者，进行二代测序，从中筛选出COL6A1和COL6A2基因突变者共6例作为研究对象，均行抗胶原Ⅵ、Ⅳ蛋白单克隆抗体免疫荧光双染，确诊为胶原Ⅵ蛋白相关肌病。 所有患者或其监护人均签署知情同意书。 二、方法 1．临床资料整理： 收集包括患者性别、起病及就诊年龄和受累肌群、关节、皮肤表现等信息，以及实验室检查结果，如心肌酶谱、骨骼肌MRI、肌电图、心肌核素显像等。 2．骨骼肌活检组织化学、免疫荧光染色病理分析： 6例患者均经本人或家属签署知情同意书后，采用2%利多卡因局部浸润麻醉，行开放式肱二头肌活检。活检标本经液氮或异戊烷快速冷冻固定，7 μm冰冻连续切片备用于组织化学及免疫组织化学染色。组织化学染色包括：HE、改良Gomori三色、还原型辅酶Ⅰ四氮唑还原酶(NADH－TR)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、单磷酸腺苷脱氨酶、细胞色素C氧化酶(COX)、三磷酸腺苷环化酶(ATPase，pH＝4.35、4.65、9.95)、酸性磷酸酶、过碘酸Schiff反应、油红O、苏丹黑B染色。6例患者的活检标本及1例作为对照的迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)患者肌肉活检标本均行免疫组织化学染色：抗胶原Ⅳ蛋白单克隆抗体(Abcam公司，英国，ab6586，稀释倍率1∶200)室温孵育1 h，二抗采用羊抗鼠IgG(Alexa Flour公司，美国，488标记，稀释倍率1∶200)再行抗胶原Ⅵ单克隆抗体(Chemicon公司，美国，MAB1944，稀释倍率1∶5 000)室温孵育1 h，二抗采用羊抗兔IgG(Invitrogen公司，中国，546标记，稀释倍率1∶200)；荧光显微镜病理分析，图像采集。 3．基因测序、致病性分析： 签署知情同意书后，对患者及其父母取静脉血4 ml，提取基因组DNA，打断成150～200 bp的片段。将3 μg提纯的DNA片段建库。利用捕获探针获取待测片段后，进行二代测序，获得的数据行生物信息学分析，对致病基因再行Sanger测序验证，基因突变进行致病性分析。父母均取血，进行家系验证。
结果 一、临床症状与体征 6例患者中男性5例，女性1例，就诊年龄平均5.8岁，起病年龄平均(2.00±0.75)岁。例6家族史阳性，其父亲和祖母均有相似临床表现；例5家族史亦阳性，家系3代中10例有相似临床表现(图1)，余4例为散发病例。 
图1 胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者家系图。A：例6家系图；B：例5家系图 6例患者幼年时均存在不同程度的运动发育迟缓，智能发育均正常，均表现为四肢近端肌无力，2例伴先天性髋关节脱位，1例跟腱挛缩，5例四肢关节过伸展、肌张力减低、腱反射减低、病理征阴性。例4呈典型松软儿综合征临床表现，例2髋关节脱位手术切口部位残留重度皮肤瘢痕。血清肌酸激酶均轻度升高，肌电图呈肌源性和(或)神经源性损害。2例行骨骼肌MRI提示大腿肌肉脂肪浸润。2例行心肌核素显像，均呈现左室壁厚薄欠均匀，提示心肌受累。全部患者的临床特点见表1。 
二、骨骼肌病理分析 1．组织化学染色： 6例骨骼肌活检病理均呈现不同程度肌营养不良表现：肌纤维直径大小不一，可见大量小径肌纤维散在，变性、坏死、再生肌纤维少见，肌束间、肌纤维间结缔组织明显增生，2例可见典型不透光肌纤维(图2)。NADH、SDH、COX等酶学染色未见特异性改变，肌纤维中糖原和脂肪成分大致正常。ATPase染色示两型肌纤维呈相间分布。 
图2 胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者骨骼肌活体组织检查病理结果，所有患者均呈现不同程度肌源性改变，其中肌束间结缔组织增生明显，坏死与再生不明显，可见核内移、不透光肌纤维。A：例1改良Gomori三色染色 ×200; B：例2 HE染色 ×200；C：例3改良Gomori三色染色 ×200；D：例4 HE染色 ×200; E：例5 HE染色 ×200; F：例6 HE染色 ×200 2．双重免疫荧光组织化学染色 作为对照的DMD患者胶原Ⅳ、Ⅵ蛋白间质、肌膜清晰表达，两者在肌膜上重合表达，呈黄色染。6例胶原Ⅵ蛋白间质、肌膜表达均存在不同程度缺失，呈绿色染(图3)。 
图3 胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者骨骼肌活体组织检查抗胶原Ⅳ、Ⅵ蛋白双染色病理结果。A～F：例1～6肌间结缔组织以及肌纤维膜呈不规则偏绿染，提示胶原Ⅵ蛋白不完全缺失 ×100；G：作为对照的迪谢内肌营养不良患者，肌肉呈均匀黄染，提示胶原Ⅵ与胶原Ⅳ蛋白表达良好 ×200 三、基因检测 6例患者均经二代测序，Sanger验证后，根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)和分子病理学会联合发布的最新指南[5]进行基因致病性分析，发现4个COL6A1基因突变(2个已报)、2个COL6A2基因新发突变、1个COL6A1和1个COL6A2复合杂合突变。突变类型包括：6个错义突变、1个剪切突变。例1和例2为COL6A1基因c.877G>A，p.G293R突变，例3 COL6A1基因c.850G>A，p.G284R突变，二者均为文献已报致病突变。例4为COL6A1基因c.1056 ＋1 G>C新发剪切突变，例5发现2个COL6A2基因新发突变，分别为c.2096G>T，p.G699V和c.2473G>A，p.A825T。例6为COL6A1基因c.860G>A，p.G287E和COL6A2基因c.1489C>A，p.P497T新发复合杂合突变，基因测序结果见表2，例6的未报道基因突变均为父源性(图4)。 
图4 胶原Ⅵ蛋白相关肌病患者家系验证测序图。箭头为患者基因突变位点及家系验证位点；例1 COL6A1基因有1个杂合突变，经过家系分析，发现其父母均无变异(A)；例2 COL6A1基因有1个杂合突变，经过家系分析，发现其父母均无变异(B)；例3 COL6A1基因有1个杂合突变，经过家系分析，发现其父母均无变异(C)；例4 COL6A1基因有1个杂合突变，经过家系分析，发现其父母均无变异(D)；例6 COL6A1、COL6A2基因各有1个杂合突变，经过家系分析，发现其父携带相同突变，其母未携带(E、F)
讨论 我们报道了一组经临床、骨骼肌病理、二代测序相结合诊断为胶原Ⅵ蛋白相关肌病，其临床表现酷似先天性肌病，主要以运动发育迟缓、肌张力减低为主要表现。中间型胶原Ⅵ蛋白相关肌病在临床极易被误诊。随着二代测序技术的发展，越来越多的基因检测在临床广泛应用，但基因突变的致病性不确切制约了疾病的诊断。 本组中的例1～3为文献已报的错义突变(COL6A1基因c.877G>A，COL6A1基因c.850G>A)，致病性确切[6,7,8]，该突变改变了三螺旋区域的G－X－Y重复序列，导致细胞外形成纤维网络功能障碍。抗胶原Ⅵ单克隆抗体免疫荧光染色可见3例均呈胶原Ⅵ蛋白缺失。另外，我们发现的1例新发剪切突变(COL6A1基因c.1056 ＋1 G>C)尚未见文献报道，ACMG致病性分析显示该剪切突变为致病性突变，抗胶原Ⅵ单克隆抗体免疫荧光染色呈胶原Ⅵ蛋白部分缺失，蛋白缺陷支持该基因变异致病。曾有文献报道该位点存在G>A剪切突变[9]，导致下游第14号外显子剪切，影响蛋白构象，进而影响蛋白功能。例5及例6均呈常染色体显性遗传，其基因检测相关突变致病性不确切，但其骨骼肌活检标本经抗胶原Ⅵ单克隆抗体免疫组织化学染色，肌纤维膜胶原Ⅵ蛋白存在部分缺失，结合分子病理均诊断为胶原Ⅵ蛋白相关肌病。在基因致病性不确切时，抗胶原Ⅵ单克隆抗体免疫组织化学染色显示相关蛋白缺陷，有助于明确诊断。 骨骼肌活检对于幼儿起病骨骼肌肌病的诊断与鉴别诊断具有重要价值，先天性肌病主要表现为胞质内异常形态，包括轴空、杆状体、中心核等，先天性肌营养不良以间质增生为主，可有肌营养不良改变，但无胞质异常形态。骨骼肌活检病理诊断有助于基因测序方向。免疫组织化学染色发现相关蛋白缺陷，有助于先天性肌营养不良的诊断。需要注意的是，在Bethlem肌病患者的骨骼肌免疫组织化学染色病理中，胶原Ⅵ蛋白表达可完全正常，因此，不能单纯凭蛋白表达有无异常判断该病，蛋白表达阳性亦不能除外诊断[10]。 胶原Ⅵ蛋白广泛分布于骨关节、皮肤、骨骼肌、巩膜等组织器官，缺陷时呈现蛋白分布组织器官受累的系列临床表现，其中关节、皮肤为常见受累组织器官。本组患者即有2例关节受累，1例皮肤受累。胶原Ⅵ为基底蛋白，该蛋白缺陷对肌细胞膜结构及功能影响不大，可解释肌酸激酶的轻中度增高。经复习中国学者报道的相关病例，我们发现获得行动能力的患者中，以肢带型肌无力表现突出；髋关节脱位的发生率在Bethlem肌病中较高[11,12,13]，而关节挛缩、运动发育迟缓、先天性斜颈在Ullrich肌营养不良中表现突出[14,15]。本组6例患者均基于基因与分子病理结果诊断，经回顾性分析临床特点，与国内外报道有所差别：本组患者以肌张力减低、四肢近段肌无力、肌酸激酶轻度升高为主要临床表现，有别于经典的Ullrich型肌营养不良和Bethlem肌病，提示胶原Ⅵ蛋白缺陷病具有广泛的临床异质性，临床症状轻重不一。 该组患者临床上需与先天性肌病鉴别诊断，但骨骼肌活检未见先天性肌病特征性病理改变，为明确诊断进行二代测序相关致病基因筛查，发现胶原Ⅵ蛋白编码基因变异，再进一步行胶原Ⅵ蛋白免疫染色验证蛋白缺陷，最终诊断为胶原Ⅵ蛋白相关肌病，可能属于介于经典的Ullrich与Bethlem肌病之间的中间型[16]。目前国内学者尚无中间型胶原Ⅵ蛋白相关肌病的研究报道。因此，当患者临床表现为肌张力减低、肌力减退、关节挛缩、脊柱侧弯等症状时，鉴别诊断应考虑先天性肌病、胶原Ⅵ蛋白相关肌病、Emery－Dreifuss肌营养不良、先天性肌营养不良等。还有文献报道以面肌、肢带肌受累的COL6A2基因相关肌病[17]以及关节挛缩症状明显重于肌无力，肌肉呈坚硬的木质感的肌硬化症(OMIM：255600)等特殊表型[18]，也应列入临床鉴别诊断谱系内。 文献报道胶原Ⅵ蛋白相关肌病骨骼肌MRI特点为除缝匠肌、股薄肌和长收肌外大腿肌群的弥漫受累，股直肌中央部分因明显脂肪浸润在T2上呈高信号(股直肌可见'中心影'征)，相较股外侧肌则为周边脂肪浸润明显而中央部分肌肉组织相对保留的'三明治'影[12,19]。 胶原Ⅵ蛋白病具有广泛的临床异质性，对于经典型临床诊断容易，中间型则需要骨骼肌活检及二代测序进一步明确。随着二代测序技术的应用，基因检测的普及性大大提高，但最终仍需要临床、病理、基因三者结合才能精确诊断。活检不能提示病理诊断时，可考虑先行二代测序致病基因筛查，再行蛋白验证，可为遗传性骨骼肌疾病的确诊提供新的诊断思路。
参考文献略
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