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胎盘发育是哺乳动物关键的生物学过程，尤其是在胚胎植入子宫之后，胎儿发育健康与否与胎盘发育的好坏密切相关。那么在胎盘发育过程中最为关键的事件就是滋养层干细胞的持续分化。目前关于小鼠滋养层干细胞的研究，我们的研究相对比较清楚。比如我们知道在维持干性相关的FGF和TGF-β等细胞因子及其下游信号通路的作用。另外，也存在几个关键的转录因子如Cdx2，Eomes，Esrrb，Elf5，Sox2等转录因子被我们熟知。那么是否还存在另外的转录因子呢？本篇文章利用单倍体干细胞以及piggyBac质粒操作系统（利用转座子整合进入基因组，影响基因组本身基因表达）对单倍体胚胎干细胞向滋养层细胞诱导分化过程中的阳性克隆进行遗传筛选。最终在候选的基因中找到了zfp281转录因子，并通过多种实验手段证明其小鼠和人滋养层干细胞中的作用。（Figure 1） 图 1. Zfp281足以诱导TS样细胞 从文章中我们得知作者利用遗传筛选手段得到了数个候选基因，其中与早期发育相关的基因是Zfp281，Rnf11和Mgat1，但是关于这三个基因在外胚层中没有具体的研究。随后作者在单倍体胚胎中过表达三个基因发现，其中只发现Znf281是主要与滋养层干细胞维持的重要基因。因此作者随后将Znf281作为后续研究方向，研究其具体在滋养层干细胞中的作用。 作者首先在单倍体胚胎干细胞中敲除Znf281,随后利用全长的Znf281以及缺失锌指结构域的Znf281进行rescue实验。作者发现KO组在胚胎干细胞向滋养层干细胞诱导体系中，滋养层干细胞的克隆数量明显减少，而rescue组转染完整基因片段的Znf281的一组实验中，滋养层干细胞的克隆数量明显变多，而缺失锌指结构域的Znf281转染没有明显的rescue现象。这个实验说明了Znf281是胚胎干细胞向滋养层干细胞发育的一个重要转录因子，而其发挥功能的关键结构是其存在的锌指结构域。（图 2） 图2. Zfp281是将ESC有效转化为TS样细胞所必需的关键基因 作者又通过对非分化和部分分化小鼠滋养层干细胞进行免疫荧光染色，发现Znf281主要大部分表达在Cdx2中的滋养层干细胞中表达，而部分分化的滋养层干细胞，Znf281的表达开始降低。作者通过实时荧光定量PCR同样证明了这一点。那么在体内条件下，Znf281能重复体外实验的结果吗？作者检测了E6.5和E7.5天小鼠胎盘Znf281的定位情况。发现Znf281主要定位在ExE和Epi，而EPC中几乎不表达。这同样说明了在体内Znf281也是主要表达在滋养层干细胞中。另外通过抑制剂抑制FGF信号通路的表达，发现Znf281表达同样受到抑制，说明Znf281的表达受到FGF信号通路的调控。（图 3） 图 3. Zfp281以FGF依赖性方式在未分化的小鼠TS细胞中表达 为了更进一步研究Znf281在小鼠体内的作用。作者利用CRISPR-Cas9技术构建了Znf281敲除的小鼠。由于之前有人报道Znf281敲除鼠在E9.5天致死。作者把取材时间设计在E8.5天至E6.5天。在E8.5天，作者观察到KO组胚胎结构不完整但内胚层发育看起来相对正常，而滋养层细胞发育却受到明显影响。接下来作者更进一步观察E6.5天小鼠结构，同样得出小鼠胚外外胚层发育受到影响的结论。为了验证Znf281具体影响了哪些基因的表达。作者通过转录组测序来比较KO组和WT小鼠之间的区别。作者发现KO组小鼠与绒毛膜与迷路滋养层细胞相关的基因表达受到明显影响。因此，可以大致得出Znf281与滋养层细胞分化密切相关的结论。（图 4） 图 4. Zfp281 KO影响小鼠胎盘正常发育 作者为了更加明确Znf281在滋养层细胞中的作用。作者分离出Zfp281KO的TS细胞进一步进行转录组测序，并和之前胎盘Znf281KO组进行对比找到一致下调的基因。作者认为它们可能是Znf281的靶基因，作者筛选到了Lin28a,Dnmt3L和Foxh1。随后在蛋白层面上也发现Lin28a和Dnmt3L水平下降。但是这些结果只是转录组水平上的变化，具体关于Znf281是否真能调节这些靶基因，作者利用ChIP-seq进一步去验证Znf281直接调控的靶基因。通过分析数据发现，Znf281能够调控的位点大量与组蛋白激活marker重合。比如H3K4me1,H3K4me3和H3K27me3。尤其是与H3K4me1和H3K4me3调控的peaks能重合80%以上。因此作者认为Znf281能够与H3K4转移酶复合物之间存在直接相互作用，事实上之前已经有报道Znf281能与H3K4甲基转移酶相互作用。这同样在KO组的H3K4me3实验结果中同意佐证了Znf281与H3K4甲基化密切相关。（图 5） 图 5. Zfp281 调控滋养层干细胞基因表达 另外，作者最后又利用最近分出的人类滋养层干细胞来看Znf281是否也存在与小鼠相类似的表型。虽然小鼠滋养层人类干细胞与人类滋养层干细胞相差比较大，但是通过在人滋养层干细胞中敲降Znf281，进行转录组测序发现Lin28a和WNT6表达也是下调的。说明Znf281在哺乳动物中调控机制应该是保守的。从后续的结果中我们发现在人滋养层干细胞Znf281的作用也是能够维护滋养层干细胞的状态。但是与小鼠不同的是，Znf281对于滋养层干细胞的分化影响并不是很明显。   总结一下，这篇文章利用多种有效工具筛选到了一个在小鼠滋养层干细胞维持中有重要的作用转录因子。虽然这个转录因子对于滋养层干细胞作用的维持没有之前已报道的Cdx2的作用那么明显，但是对于我们认识小鼠滋养层干细胞的特殊的调控方式有了进一步加深。另外，我们知道小鼠滋养层干细胞与人滋养层干细胞的调控方式相差较远。我们对于人滋养层干细胞干性维持以及分化的调控机制研究相对很浅。这对于之后的研究者来说，既是挑战也是机遇，尤其随着人滋养层干细胞已经分离出来，我们就有了一个非常适合的研究model进行后续深入研究人滋养层干细胞的功能。 参考文献 Ishiuchi T, Ohishi H, Sato T, Kamimura S, Yorino M, Abe S,Suzuki A, Wakayama T, Suyama M, Sasaki H. Zfp281 Shapes the Transcriptome ofTrophoblast Stem Cells and Is Essential for Placental Development. Cell Reports, 2019. 27, 1742–1754  |
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