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郎中点评： 抗体C末端的赖氨酸是引起抗体电荷异构的主要因素之一，很多公司在分子构建时已经把lysine给去掉了，那么去掉了到底好不好呢，本文是genetech公司对IgG1抗体C端lysine去除的一个很好的研究。 背景 单克隆抗体的异质性通常是有不同修饰途径造成的，如糖基化、脱酰胺、氧化、赖氨酸羟基化、N端谷氨酰胺环化、C端赖氨酸切除、脯氨酸酰胺化等等。很多修饰通常是人们不希望有的，而且难以通过有效的手段进行控制。其中抗体的电荷异构体通常是抗体研发阶段需要予以关注的。 通常细胞培养所表达出来的抗体C末端的lysine是被切除掉的，这是由羧肽酶催化完成的，例如羧肽酶D（CpD）。其结果则会导致抗体每条重链C端有0或者1个lysine。然而当C端lysine被切除后，末端的glycine会在PAM酶的作用下将末端的glycine切除，最终形成以酰胺化的脯氨酸为C末端。无论是C端lysine的切除，还是脯氨酸的酰胺化都会引起抗体电荷的变化。 为了降低电荷异质性以及批与批之间的差异，作者构建了三种不同的C端的抗体（第一种为野生型的末端含有GK的重链、第二种为lysine（K）去除的重链、第三种为GK都去除的重链）作者前期研究表明这些去除之后对稳定性、PK影响不大（未列出数据）本文主要考察了C端的氨基酸对于抗体表达和抗体质量的影响 结果 1、 C端去掉K后会影响抗体Qp 作者构建了两种抗体质粒，转染CHO细胞后挑选了216个克隆，表达量前十二位的克隆用于流加培养测试表达能力。结果很明显去掉K的的分子Qp显著降低。于是作者又构建了第3种抗体Mab3进行验证，这次挑选了528个克隆。表达量前20位的克隆挑选出来进行流加培养。结果表明K去掉的分子式表达量最低的。Qp的titer降低了将近一倍。这也验证上面的结果。上述实验充分说明了重链C端的lysine切除会降低抗体的Qp。 在Mab3的基础上将表达量前20的克隆合并形成pool，然后进行流加培养，结果如下图所示，结果表明不同分子之间IVCC差异不大，但是去掉K的分子的Qp和titer显著的降低。CEX-HPLC分析发现-K型的碱性组分比WT型的高了15.6%。分析表明-K型的脯氨酸酰胺化的水平达到16.9%，这是导致碱性组分增加的主要原因。然而-GK型的碱性组分只有3.5%。每一个克隆也有相通的趋势。 2、 克隆表达-K型抗体会提高重链的降解速率 对Mab3表达量前20的克隆组成的pool进行胞内western blot发现-K型重链显著低于其它型分子，而轻链差异却不大（下图A）。mRNA分析发现-GK型的重链mRNA水平是最高的，轻链mRNA水平基本一致（下图B），这表明了mRNA并不是引起-K型下降的主要原因。由于-K型的胞内重链是最低的，定量泛素与HC的Western blot的信号比揭示了重链-K的泛素比率是其他类型的2倍，说明了可能-K有较高的重链降解速率。 接着作者通过分析抗体的糖型来表征重链在ER/高尔基体中的加工途径，只要抗体重链存在于ER中，N糖对于EndoH的酶切很敏感，然而所有的重链糖链对PNGF的酶切都敏感，无关于他们的位置。图D表明所有类型抗体的用EndoH和PNGF处理后基本一致。 3、表达-K型抗体的细胞有较低的抗体和成速率 细胞用cyclohexamide(CHX)处理用于阻止蛋白的合成，在6小时内几乎所有的胞内抗体都分泌到了培养基中（下图A），去掉CHX后检测0h和2h抗体的合成情况，发现-GK型胞内的重链最高，表明了其分泌受到抑制，而WT性和-K型却非常低。-K型胞内累积新合成的重链只有WT型的42%，远远小于-GK型。有趣的是对于-GK型的重链的翻译、转移和折叠是最快的，这可能部分是由其mRNA的水平比较高造成的。较高的抗体生产速率揭示了mAb3中-GK型具有较高titer和Qp。研究也揭示了-K型抗体的翻译、转移和折叠速率要低于其他两种类型。总的来讲，-K型的抗体胞内重链的累积速率较低、胞内抗体降解率则较高，这导致了总体的titer和Qp下降。 讨论 分子中去掉C端的K则会显著影响碱性电荷异构体，主要是由于更多的脯酸酰胺化形成。然而当C端GK都去除后重链C端的电荷异质性则会非常的低，与此同时抗体的表达量与野生型相同甚至更高。需要注意的是本文所有试验抗体都是IgG1类型。 参考文献 Zhilan et al. Evaluation of Heavy Chain C-terminal Deletions on Productivity and Product Quality of Monoclonal Antibodies in Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells. 2017 Biotechnology Progress |
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