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IHC 中的显色检测方法依赖于将可溶性底物转化为不溶性显色产物的酶。 这些酶通常与二抗结合，二抗与针对目的蛋白的一抗结合。也可使用直接与酶结合的一抗。最常用的酶包括将 3,3’-二氨基联苯胺 (DAB) 转化为棕色产物的辣根过氧化物酶 (HRP) ，以及将 3-氨基-9-乙基咔唑 (AEC) 转化为红色产物的碱性磷酸酶 (AP)。 由于该方法中信号放大更高，显色检测通常比荧光检测更敏感。此外，与荧光团不同，底物（如 DAB）生成的有色沉淀物具有光稳定性，能够将载玻片储存多年。区别于需要专门光源和滤光片的荧光检测，显色检测只需要标准的显微镜。但其实验程序比荧光法要长，因为包括了更多的孵育和封闭步骤。 如今，四种主要的间接显色检测方法得到了广泛应用。基于生物素的方法使用亲和素-生物素复合物 (ABC) 或标记的链霉亲和素-生物素结合 (LSAB) 复合物。基于非生物素的方法采用聚合物复合物或微聚合物复合物。 亲和素-生物素复合物 (ABC) 法 早期使用 ABC 法依赖于生物素化二抗和亲和素-生物素-报告酶复合物。由于亲和素是四价的，形成了大的复合物，因此信号强度较高。  标记的链霉亲和素-生物素 (LSAB) 法 现在，大多数检测依赖于 ABC 方法的 LSAB 变体，该变体使用链霉亲和素，而非亲和素。这导致非特异性组织结合较少，因为链霉亲和素没有糖基化，且等电点比亲和素要中性得多。 查看完整的 LSAB ABC 法 IHC 检测试剂盒，或者您自己将试剂与生物素偶联的二抗、链霉亲和素-酶结合物和显色底物试剂盒进行结合配套。  聚合物法 对于基于生物素的系统，关键挑战在于内源性生物素可导致某些组织（例如脑）出现显著的背景染色。福尔马林固定和石蜡包埋可降低生物素水平，抗原修复可导致生物素暴露。在冰冻切片中，内源性生物素是一个显著的问题。虽然可以使用生物素封闭液的额外步骤来降低背景，但基于非生物素聚合物的方法提供了一种替代方法。早期的聚合物法使用的是葡聚糖骨架，上面连接有多个酶分子和二抗。 性能出色的微聚合物/致密聚合物法使用的检测复合物较小，聚集倾向较小。通过更好的组织穿透性和内源性生物素减少背景染色来获得更高的灵敏度。 查看完整的微量聚合物 IHC 检测试剂盒，或者您自己将试剂与 HRP-聚合物偶联的二抗和显色底物试剂盒进行结合配套。  多色检测 IHC 如果对多种抗原感兴趣，则可以使用不同颜色的显色剂同时对多达三种不同的抗原进行染色。这通常需要在不同种属中培养的一抗，除非抗原水平足够高，可以使用与报告酶直接偶联的一抗。 |
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