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CHO细胞简介 1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。 该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。另外CHO细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。可形成有活性的二聚体(如白介素2)，具有糖基化的功能(如EPO)，CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。 由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸--半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。 工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n=22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。 注：图片选自互联网 重组蛋白表达的主要环节 ①基因的克隆和基因工程菌的构造； ②重组细胞的培养； ③目的产物的分离纯化等。 CHO细胞表达蛋白的优点 ①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； ②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； ③具有重组基因的高效扩增和表达能力； ④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高； ⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。 CHO细胞表达系统的发展 CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。 目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达(表2)，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。 注：图片选自互联网 近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。 另有研究者尝 试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM中生长良好。 CHO细胞表达系统启动子 启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、LTR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子>LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。 来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前导序列，使CHO细胞表达EPO的水平增加了2l倍和l6倍。在实际应用中所有的生产细胞系都是用强的、组成 型启动子。 SR启动子(SV40早期启动子+HTLV)比SV40早期启动子表达水平提高约5倍。 与启动子相连的是增强子元件，也是一种调节基因转录的顺式作用元件，具有种和组织特异性。病毒增强子的主要优点是病毒包装要求增强子位于mRNA帽子位点附近，从而形 成紧密型表达载体CHO细胞中一般使用SV40和CMV增强子。增强子可位于载体中两个启动子之间，为两个启动子公用。 CHO表达系统的外源基因 位于启动子之后的是克隆的基因序列，或被表达的外源蛋白的cDNA。外源基因的结构 可在翻译水平上调控它的表达效率，这种调控机理很复杂，目前尚不清楚。但是在启动子一定的情况下，可以通过下列方法增加外源基因的表达量： ①在加工和剪接途径中引入一个指导前体mRNA合成的内含子序列； ②引入一个促进mRNA翻译的序列； ③拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌物和膜结合蛋白的输出等； ④在不改变基因产品氨基酸序列的前提下修饰个别基因的编码序列，解决密码子偏性问题； ——部分内容选自互联网 |
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