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摘 要：目的 延胡索为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎。其味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有活血、利气、止痛之功效，用于治疗胸胁、脘腹疼痛等疾病[1]。延胡索中主要化学成分为生物碱类，包括叔胺碱和季铵碱，其中叔胺碱类研究较多，叔胺碱类物质主要起镇痛作用，季铵碱类物质研究报道较少，延胡索季铵碱可以起到抗心肌缺血的作用[2-3]，但其具体的作用机制鲜有报道。分子对接方法（molecular docking method）是通过化学计量学方法模拟分子的几何结构和分子间作用力来进行分子间相互作用识别并预测受体- 1 材料与方法 1.1 TCMSP平台 UniProt数据库（http://www.）；DrugBank数据库（http://www.）；BindingDB数据库（http://www.）；PDB数据库（http://www.）；ChemDraw Professional 15.0软件；Chem3D 15.0软件；薛定谔软件Maestro 11.1；Cytoscape 3.6.1软件。 1.2 通过传统中药药理数据库TCMSP平台收集延胡索的目标化合物，初步收集到77种小分子化合物结构。通过口服生物利用度（OB）＞30%，类药性（DL）＞0.18筛选得到33种小分子化合物[6]，其中叔胺碱19种、季铵碱11种、甾醇1种、有机酸1种、黄酮类1种。本对接实验选取已上市药曲美他嗪（trimetazidine）[7]、维拉帕米（verapamil）[8]、地尔硫卓（diltiazem）[9]为参考。选取好的化合物通过ChemDraw Professional15.0软件进行结构绘制，再转换成三维结构保存为Mol格式，在Chem3D15.0软件界面进行化合物能量最小化处理，力场选择MM2，完成能量最小化处理后保存备用。 1.3 心肌缺血相关靶点蛋白的选择 1.4 分子对接步骤、参数的设定以及受体活性口袋的确定 应用薛定谔分子对接软件Protein preparation wizard模块进行蛋白准备，加氢，加电荷，删掉水分子；蛋白受体格点创建以及活性口袋坐标的确定，以晶体结构中原配体为中心生成格点文件，盒子大小设为1 nm（10 Å），其他参数选择系统默认值。采用LigPrep模块进行配体处理，选择Epik方法产生pH 7.0±2.0所有的构象，其他的选择系统默认值；Ligand Docking模块进行配体[11-12] 1.5 小分子化合物与靶点蛋白作用网络的构建 采用Cytoscape 3.6.1软件构建多成分和靶点网络模型。 2 结果 2.1 分子对接结果 心肌缺血相关的靶点信息见表1，3种已上市药物、目标化合物与靶点蛋白对接得分见表2，其中靶点STAT3的对接结果未列出。药物成分与靶标的结合模式见图1，化合物-靶点蛋白网络见图2。 季铵碱类化合物中，由表2和图2数据分析得知，去氢紫堇达明（dehydrocorydalmine）、非洲防己碱（columbamine）、黄连碱（coptisine）、去氢紫堇鳞茎碱（dehydrocorybulbine）、13-甲基巴马士宾8种化合物获得较好的对接结果。去氢紫堇达明与6个靶点（PAR2、BAX、NF-κB1、CASP3、TNF-α、RYR2）具有较好结合。观察去氢紫堇达明与这几种靶标的结合模式可以发现其与靶标主要通过氢键（H-bond）、π-π堆积（π-π stacking）和阳离子-π（cation-π）等相互作用进行结合。例如，在与RYR2的结合中，去氢紫堇达明的羟基与Leu92形成氢键；在与BAX的结合中，其带正电荷氨基Tyr100形成cation-π相互作用；在与CASP3的结合中，其芳香环结构与Phe256之间形成π-π相互作用。非洲防己碱与COX2、JNK1、RYR2和ICAM1结合较好，其羟基可以与靶标蛋白的残基形成氢键（如与COX2的Tyr371），其环状结构可以与芳香性残基形成π-π堆积（如与ICAM1的Trp395）。黄连碱与ICAM1、TNF-α、JNK1、CASP3和INOS这5个靶点结合较好，其与靶标的主要作用方式是通过氢键和π-π堆积。去氢紫堇鳞茎碱与COX2、TNF-α和AKT1结合较好，其与AKT1的结合模式见图1-A。由图可见，去氢紫堇鳞茎碱的羟基与Asn53的羰基形成1个氢键，同时其环状结构与Trp80形成π-π共轭。13-甲基巴马士宾与3个靶点（COX2、BCL2、AKT1）有较好结合，在与BCL2的结合中其氮正离子与Asp100的羧基形成盐桥。药根碱与COX2、ICAM1、CASP9结合较好。药根碱与CASP9 槲皮素（quercetine）与PAR2、BAX、NF-κB1、JNK1、TNF-α、RYR2、CASP9、AKT1、ICAM1、HSP70、BCL2 11个靶点的对接结果较好。槲皮素是黄酮类化合物，含有1个羰基和5个羟基，即同时具备多个氢键受体和氢键供体，因此其与靶点蛋白的主要作用模式为氢键。图1-C为槲皮素NF-κB1的结合模式，由图可见槲皮素的羰基氧和临近羟基的氧原子与Mg2+螯合，羰基氧与Lys517形成1个氢键，同时其还可与Asp515、Asp534、His537形成氢键。 叔 在16种心肌缺血靶点对接结果中，8种季铵碱化合物、1种黄酮类、2种叔胺碱类显示出了较好的对接结果。季铵碱类化合物和黄酮类槲皮素对接结果普遍优于叔胺碱类，有10种靶点蛋白与季铵碱的对接打分平均值高于叔胺碱，分别是AKT1、TNF-α、RYR2、JNK1、ICAM1、COX2、CASP3、PAR2、BAX、ATP2A2。STAT3仅与少数几个化合物对接成功，STAT3空腔含有Lys591、Arg609等带正电荷的残基。季铵碱或叔胺碱类化合物空间体积较大且季铵碱类化合物带正电荷，因此这类化合物与STAT3的结合均较差 2.2 化合物-靶点蛋白网络及网络拓扑分析 利用Cytoscape 3.6.1作化合物和靶点蛋白相互作用的网络药理图[13]，结果见图2，网络异质性为0.57，平均相邻节点数3.59，特征网络长度3.02，网络中心度0.21，从网络药理学结构图及拓扑参数可以看出，延胡索中小分子化合物存在着一个化合物与多靶点相互作用的情况，也存在着多个化合物与同一个靶点相互作用的情况，这体现出了中药的多成分能够与多靶点作用的特性。 3 讨论 对 中药治疗心肌缺血机制主要与清除氧自由基、减轻钙超载、改善能量代谢、干预炎症反应、调节血管内皮因子、抑制细胞凋亡有关[14-15]。在清除氧自由基方面，诱导性一氧化氮合酶（iNOS）是一种合成血管内皮舒张因子NO的酶，适量的NO可以起到抑制血小板聚集、舒张冠脉、保护心肌细胞作用。iNOS过量表达时可产生过量NO，过量的NO与氧迅速反应产生大量氧自由基，从而会加重心肌细胞损伤。黄连碱与INOS的结合，可能是抑制iNOS活性，减少氧自由基产生，减少由iNOS引发的血管内皮细胞凋亡，对抗心肌缺血梗死引起的炎症反应，以此达到治疗心肌缺血作用[16]。 在抑制心肌细胞凋亡方面，Caspase家族是细胞凋亡级联反应过程中重要的酶，是细胞凋亡级联反应中重要一环，Caspase-3是细胞凋亡的关键效应因子，可以对部分关键性蛋白酶进行激活或灭活。小檗碱、巴马汀和药根碱能够与Caspase-3、Caspase-9很好结合，可能是通过抑制Caspase级联反应，导致部分关键性蛋白酶灭活，使得凋亡反应的中间过程终止，从而达到保护心肌细胞作用[17-19]。Bcl-2/Bax是一对与细胞凋亡密切相关的靶蛋白，Bcl-2主要起抗凋亡作用，Bax作用则相反，起到一个促进凋亡的作用。四氢原罂粟碱与这2个靶点结合较好，可能起到上调Bcl-2表达，下调Bax表达作用，通过改变Bcl-2/Bax比例，抑制细胞色素C从线粒体释放，从源头上终止了心肌细胞凋亡反应，从而起到抗心肌缺血作用[20]。 在干预炎症反应方面，核转录因子NF-κB1不仅在免疫应答、细胞生长调控方面起着重要作用，同时NF-κB1可以诱导表达ICAM、IL等炎症蛋白。槲皮素与核转录因子有较好结合，可能是通过降低NF-κB1活性，下调HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路，继而抑制炎症因子IL-6和IL-1β浓度，达到抗心肌缺血作用[21]。丝氨酸/苏氨酸激酶1（Akt1）是PI3K-AKT信号通路的一个重要的蛋白激酶，Akt1的活化在心肌细胞缺血再灌注损伤保护过程中发挥重要作用，去氢紫堇鳞茎碱与AKT1结合后，可能导致Akt1被激活，进而起到抑制Caspase家族成员活性，导致心肌细胞凋亡反应中间步骤终止，达到保护心肌细胞作用。 在减轻钙超载方面，叔胺碱clarkeannidine可能起到提高ATP2A2活性作用，增强心肌细胞在缺血再灌注损伤后ATP2A2对Ca2+摄取能力，激活PI3K/Akt信号通路，升高Akt磷酸化水平，逆转内质网应激相关凋亡通路及活化下游的信号分子，减轻舒张期心肌细胞内细胞钙超载[22]，从而达到抗心肌缺血作用。 综合以上对接数据以及网络药理结构关系分析，延胡索季铵碱类物质如黄连碱、巴马汀、去氢紫堇鳞茎碱、药根碱、非洲防己碱、小檗碱，黄酮类槲皮素可能是延胡索治疗心肌缺血的主要的物质基础。季铵碱类和黄酮类物质主要是通过氢键、π-π堆积、cation-π、疏水占据与相关靶点相互作用，从而发挥抗心肌缺血作用。黄连碱、小檗碱、巴马汀、药根碱等季铵碱类化合物的抗心肌缺血作用已经被实验验证，而非洲防己碱、13-甲基巴马士宾、13-甲基去氢紫堇达明则缺少心肌缺血药效方面的实验论证，因此本研究结果可以为后续研究延胡索治疗心肌缺血物质基础提供思路和参考。 参考文献（略） 来 源：黄启和，周福军，徐 旭，涂正伟，梁小娜，赵 鑫，孟凡翠，侯文彬. 基于分子对接技术虚拟筛选延胡索抗心肌缺血物质基础研究 [J]. 中草药, 2019, 50(10):2355-2361.
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