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前言 中心体控制细胞运动，极性和迁移，这被认为是由它们的微管组织能力介导的。5月29日加拿大多伦多西奈山医院与多瑞尔森大学化学与生物系团队在Nature Communications上发表了“Atypical function of a centrosomal module in WNT signalling drives contextual cancer cell motility”，文章证明WNT信号传导驱动一种独特形式的非定向细胞运动，需要一个关键的中心体模块，而不是微管或中心体。在外泌体动员PCP蛋白时，显示DVL2协调CEP192-PLK4/AURKB复合物向细胞皮质的募集，其中PLK4/AURKB冗余地起作用以驱动前突活性和细胞运动性。这是通过用于DAAM2的皮质局部DAAM1的置换来协调依赖于formin的肌动蛋白重塑来介导的。此外，PLK4，AURKB和DAAM1的异常表达与乳腺癌和膀胱癌的不良预后相关。因此，中心体模块在WNT信号传导和肌动蛋白成核中起非典型功能，这对于癌细胞运动是至关重要的，并且与更具侵袭性的癌症相关。这些研究对于背景信号如何控制不同的细胞迁移模式具有广泛的意义。  研究思路  Figure 1：外泌体以中心体和MT非依赖性方式刺激基于肌动蛋白的非定向迁移。 a实验示意图。 b用DMSO或centrinone处理MDA-MB-231细胞。显示了CETN1和CEP192染色. c（b）细胞的百分比> 4 centrioles，1≤centrioles≤4和0 centrioles。 d将MDA-MB-231细胞用DMSO或centrinone处理，然后与DMEM或ACM一起温育过夜.数据与单向ANOVA Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn多重比较进行后检验。e将来自（d）的MDA-MB-231细胞染色为α-微管蛋白，肌动蛋白和中心体。 f用PBS或纯化的外泌体刺激的细胞的均方位移。 g来自用DMEM或ACM处理过夜的MDA-MB-231细胞的伤口愈合测定的定量数据。h用DMEM或ACM刺激MDA-MB-231细胞过夜。然后，在用DMSO或Nocodazole处理后进一步追踪相同的细胞。i用ACM刺激MDA-MB-231细胞过夜。在刺激的最后添加DMSO或NOC。 j用DMEM或ACM刺激MDA-MB-231细胞过夜。追踪细胞运动用DMSO，细胞松弛素B或细胞松弛素D处理细胞，并进一步追踪。  Figure 2：CEP192的非中心体库控制ACM诱导的运动性。 a，用Control，CEP192或PRICKLE1 siRNA转染MDA-MB-231细胞，然后用ACM刺激过夜。然后将细胞染色α-微管蛋白和肌动蛋白。 b用DMSO或centrinone处理MDA-MB-231细胞。加入药物后，用指定的siRNA转染细胞，并进一步培养。孵育结束时用DMEM或ACM处理细胞过夜，并且拍摄延时图像以跟踪细胞运动性。 c用siRNA转染MDA-MB-231细胞。然后固定细胞并染色PCNT和α-微管蛋白。 d从三个独立的实验测量来自（c）的细胞中MTOC的α微管蛋白强度。 e细胞运动性测量为用指定的siRNA转染的MDA-MB-231细胞的平均速度，然后用DMEM或ACM处理过夜。  Figure 3：PLK4和AURKB/C冗余调节ACM诱导的癌细胞运动。 a在DMEM或ACM存在下，用DMSO或不同浓度的CFI-400945处理MDA-MB-231细胞。 b在ACM刺激存在下，用DMSO或CFI-400945处理MDA-MB-231细胞。 c在DMEM或ACM存在下，用centrinone，centrinone B，AZD或它们的组合处理MDA-MB-231细胞过夜。 d（c）细胞染色α-微管蛋白和肌动蛋白，皮质区域在右侧板上扩大。 e将细胞与DMEM或ACM一起温育过夜。在服用延时图像时，将DMSO或抑制剂加入细胞中并继续培养，然后洗去DMSO或抑制剂，并将细胞在DMEM或ACM中再培养. f在DMSO或抑制剂存在下，用DMEM或ACM处理乳腺癌细胞系EpRas和MDA-MB-468.  Figure 4：DVL2通过与PLK4，AURKB和CEP192结合来控制ACM诱导的癌细胞运动。 a从LUMIER筛选中鉴定的选定蛋白质相互作用的网络图，测试CEP192，PLK4和AURKs对3个Flag标记的WNT-PCP和中心体因子的集合。 b用3Flag-CEP192和3HA-PLK4或3HA-DVL2共转染HEK293T细胞。用抗Flag抗体免疫沉淀细胞裂解物，通过蛋白质印迹检测3HA-DVL2或3HA-PLK4。 c，d GST，GST-AURKB（c）和GST-PLK4（d）被细菌表达，纯化并与或不与来自MDA-MB-231细胞的细胞裂解物一起温育。进行GST下调，通过蛋白质印迹检测内源性DVL2。 e用对照或DVL2 siRNA处理MDA-MB-231细胞，然后用DMEM或ACM刺激过夜.测量细胞运动性，并使用单因素ANOVA Kruskal-Wallis检验进行分析，并使用Dunn多重比较检验进行后测试。 f用对照或DVL2 siRNA转染稳定表达四环素可诱导的C末端HA标记的DVL2-wt，DVL2-N末端或DVL2-C末端的MDA-MB-231细胞。测量细胞运动性，并通过双尾Mann-Whitney U检验进行分析。  Figure 5：DVL2协调突出时CEP192的募集。 a，c用对照，CEP192或DVL2 siRNA转染MDA-MB-231细胞，然后用DMEM或ACM刺激过夜。对细胞进行染色（a）CEP192和肌动蛋白，或（c）CEP192和PCNT。 b，d，e CEP192在细胞皮质（b），中心体（d）和中心体（e）的PCNT信号的强度进行测量。  Figure 6：细胞突起处的PLK4和AURKB积累取决于它们的特定活性。 a，c在MDO，Centrinone或AZD存在下用DMEM或ACM刺激MDA-MB-231细胞。对细胞染色肌动蛋白和（a）磷酸-PLK4，或（c）磷酸-AURKB。 b，测量（b）磷酸-PLK4（S305）或（d）来自（a）和（c）中细胞的磷酸-AURKB（T232）在皮质区域的强度。磷酸-PLK4（e）和磷酸-AURKB（f）在细胞皮质中定位的模型，以促进独立于其他激酶活性发生的突起形成。  Figure 7：DVL2和CEP192在细胞突起处协调PLK4和AURKB的募集。 a，c用对照，PLK4，AURKB，CEP192或DVL2 siRNA转染的MDA-MB-231细胞用DMEM或ACM刺激过夜。对细胞染色肌动蛋白和（a）磷酸-PLK4，或（c）磷酸-AURKB。（b）的磷酸PLK4，或（d）磷酸AURKB在皮层区域从在（a）和（c）中的细胞中测量。 （e）磷酸-PLK4（S305）和（f）磷酸-AURKB（T232）在细胞皮质中募集和定位以促进通过DVL2和CEP192形成突起的模型。  Figure 8：DVL2有助于AURKB从细胞核输出和PLK4稳定化。 a用对照或DVL2 siRNA处理MDA-MB-231细胞，然后用DMEM或ACM刺激过夜。对细胞进行肌动蛋白，AURKB和细胞核（DAPI）染色。 b在DMSO或细胞出口抑制剂Leptomycin存在下，用DMEM或ACM刺激MDA-MB-231细胞过夜。用α-微管蛋白，AURKB和DAPI染色细胞。 c，d分别对来自（a）和（b）中细胞的AURKB的核与细胞质（N/C）比率进行定量。 e在DMSO，LMB或LMB + centrinone存在下，用DMEM或ACM刺激细胞过夜。 f用于DVL2调节AURKB的核和细胞质/皮质池的模型。 g用3HA-PLK4,3 Flag-BTRC和增加量的T7-DVL2-wt或T7-DVL2突变体转染HEK293T细胞。 h在增加量的DVL2存在下PLK4和BTRC之间结合的定量显示为免疫沉淀物中HA-PLK4/3F-BTRC的平均信号比。 i 为DVL2介导的PLK4稳定模型。  Figure 9：PLK4和AURKB通过DAAM调节细胞运动。 a在DMSO，CK666或SMIFH2存在下，用DMEM或ACM刺激MDA-MB-231细胞过夜。 b用对照或SPIRE1 siRNA转染细胞，然后用DMEM或ACM处理过夜。 c用对照，DAAM1或DAAM2个体siRNA寡核苷酸转染细胞，然后用DMEM或ACM刺激过夜。 d在DMSO或centrinone+AZD存在下，用DMEM或ACM刺激（e）MDA-MB-231细胞。 f，g用对照，DAAM2或DAAM1 siRNA转染细胞，然后DMEM或ACM刺激过夜。对肌动蛋白和（f）DAAM1或（g）DAAM2染色细胞。 h用对照，DAAM1，DAAM2 siRNA或指定的组合转染MDA-MB-231细胞，然后用DMEM或ACM刺激过夜。 i用对照，DAAM1或DAAM2 siRNA转染MDA-MB-231细胞，然后在DMSO或centrinone+AZD存在下用DMEM或ACM刺激过夜。 j由PLK4和AURKB调节的ACM处理后细胞皮层DAAM1和DAAM2定位开关的模型。 结论 先前表明外泌体诱导的BCC迁移和侵入行为受WNT信号传导途径的调节，该途径需要与PCP途径组分相互作用。还发现，在突出的非突出侧膜上，PCP蛋白PK1与RhoGAPs Arhgap 21/23配合以促进细胞运动和突起形成。这里给出由WNT-PCP蛋白DVL2募集的中心体蛋白的离散模块对响应于WNT信号传导的突起的促进作用的意外作用，促进外泌体/ACM驱动的非定向细胞迁移，其独立于MT和中心体发生。发现中心体重复的两个主要促进因子（CEP192和PLK4）和PCM组装体作用于WNT-PCP蛋白DVL2的下游，其响应于外泌体刺激的WNT信号传导而协调它们向细胞皮层的募集。因此，揭示了这两种生物途径之间的意外串扰，并确定了该模块在细胞运动的背景控制中的作用。 外泌体/ACM诱导的细胞运动是非定向的，并且其潜在机制可能与定向迁移竞争。这是相当重要的，因为PLK4已被证明分别通过ARP2 / 3-和MT依赖性过程调节2D和3D细胞培养中的定向迁移/侵袭。值得注意的是，发现这些介质在外泌体/ACM诱导的细胞运动中是不必要的。PLK4在两种类型的迁移中的独特作用提出了诱人的假设，即该激酶在响应特定刺激信号的细胞迁移的背景控制中起关键作用。独立于PLK4活性，AURKB也被DVL2-CEP192募集到细胞突起以激活迁移。已经显示抑制AURKB抑制骨肉瘤和HepG2细胞迁移和侵袭，而过表达的AURKB定位于间期正常大鼠肾细胞的细胞核和皮质肌动蛋白丝。尽管AURKB在细胞迁移中的新兴作用仍有待完全确定，但这些研究强调了AUKRB在细胞迁移中的重要性。 有趣的是，临床数据显示PLK4和AURKB在高级别膀胱癌中的表达增加，并与乳腺癌患者的生存率降低相关。因此，重要的是确定PLK4和AURKB是否也在体内冗余，并且如果PLK4和AURKB的共抑制可以阻断或减少转移，因为PLK4/AURKB主要被视为细胞周期调节剂并且在此基础上已经大量药物开发工作的主题。研究表明，通过双重抑制PLK4和AURKB来靶向背景非定向细胞运动可能是癌症临床中的重要治疗目标。 文章提出AURKB/PLK4可能在皮层的肌动蛋白重组中起作用。实际上，ACM刺激的BCC迁移取决于DAAM1和DAAM2之间的皮质转换或交换，其由PLK4或AURKB活性调节。最重要的是，通过RNAi耗尽DAAM1绕过了这两种激酶在细胞迁移中的需要，表明它们在相同途径中起作用。然而，AURKB/PLK4如何调节ACM处理后从细胞突起中去除DAAM1仍然是未知的，并且将是进一步研究的重要主题。 因此，研究揭示了WNT信号传导和肌动蛋白成核中的中心体模块的非典型功能，这对于癌细胞运动是至关重要的。更重要的是，该模块中基因的失调包括PLK4，AURKB，DAAM1和DAAM2与侵袭性形式的人类癌症相关。值得注意的是，DAAM1是在原代模型中显示出更高的肺转移倾向的MDA-MB-231细胞亚群中表达降低的47个基因之一。此外，原位与浸润性导管癌乳腺癌之间的地形单细胞测序比较显示，CEP192是来自特定突变的侵入性特征的11个错误调控基因之一，进一步支持该模块在癌症迁移和侵袭中的作用。 总之，文章提供了中心体模块的证据，该模块在WNT信号通路中执行独立于其中心体作用的功能，通过直接调节通过formins的肌动蛋白重组并反过来促进癌细胞迁移。推测这种途径可能至少部分地调节与癌症无关的其他功能，这是非常诱人的。尽管AURKB-/-胚胎通常是植入的，但与研究结果一致，AURKC在胚胎发生过程中取代了AUKRB功能，因此AURKB在胚胎发育中的重要性可能仍然受到重视。进一步研究AURKB和PLK4在人类胚胎/组织发育中的作用将是有趣的，特别这些激酶的冗余功能仍未被发现。最后，这里鉴定的中心体模块是否在细胞运动的上下文控制中具有任何其他发育和无数其他疾病相关背景中的任何作用，将是进一步研究的重要领域。 全文链接: https://pan.baidu.com/s/1Ye1IRo-BSMWc346nhXrphw 提取码: a3na EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。 |
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