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神经系统具有强大的收集和整合外界环境信息的能力，并能据此精确地控制机体的适应性生理反应。自古以来就有很多猜测认为大脑神经活动能以某种方式产生可遗传的变化，从而影响子代的命运【1】。这种猜测虽然产生了深远影响，并且很有吸引力，但违背了德国生物学家魏斯曼(1834～1914) 提出的著名的“魏斯曼屏障（Weismann Barrier）”学说，即只有发生在生殖细胞中的变化才是可以遗传的，而出生后由环境改变引起的变化是不能遗传的【2】。近年来越来越多的研究显示亲代的神经反应会影响后代的行为，但其内在的影响机制仍不清楚【3, 4】。 2019年6月6日，以色列特拉维夫大学Oded Rechavi领导的团队在Cell杂志发表长文Neuronal Small RNAs Control Behavior Transgenerationally，揭示了神经元中表达的双链RNA（dsRNA）结合蛋白RNAi deficient 4（RDE-4）通过调控小RNA的生物合成来控制线虫趋化行为的代际间传递。 在siRNAs（small interfering RNAs）合成过程中，RDE-4能与DCR-1结合并将dsRNA分子加工成为内源siRNAs，而内源siRNAs又会被Argonaute ERGO-1进一步处理【5】。为了构建只在神经元中产生rde-4依赖性内源siRNAs的线虫，作者首先在rde-4突变体线虫神经元中特异性回补了rde-4的表达。为鉴定神经小RNAs的表达，作者构建了Illumina测序兼容文库，并对包括N2野生型线虫、rde-4突变体线虫和rde-4突变体神经元回补线虫（transgenic worms that express rde-4 just in neurons）在内的64个siRNAs文库和27个mRNA文库进行了测序，共鉴定到了476个上调的靶向特定基因的小RNAs单位（small RNA targeting a specific genes, STGs），这些STGs具有典型的RDE-4依赖性小RNAs的特征。同时，这些上调的STGs也与DCR-1依赖性siRNAs、RGO-1结合的内源性siRNAs和体细胞MUT-16依赖性内源性siRNAs产生了富集。此外，也有744个STGs发生下调，这些siRNAs不具有RDE-4依赖性，暗示了RDE-4在这些STGs的下调中发挥了间接作用。 图1 神经元的分选（A）、RNA测序（B）及神经元中RDE-4依赖性小RNAs与靶向mRNA的鉴定（C, D） 随后作者从N2野生型线虫、rde-4突变体线虫和rde-4突变体神经元回补线虫中利用RFP标记和流式细胞分选法分离了神经元（图1 A），并对分离得到的细胞进行了小RNAs和mRNA测序（图1B）。通过比较rde-4突变体线虫及其神经元回补线虫，并进行STGs富集分析，作者发现46个神经元STGs具有RDE-4依赖性小RNAs的特征（图1 C）。这些STGs靶基因中，当在神经元中特异性回补RDE-4时，有9个靶基因的mRNA水平受到影响（图1 D）。因此，神经元特异性RDE-4回补实验结合神经元分离，使神经元RDE-4依赖性内源性siRNAs的鉴定成为可能，通过该方法也能探究神经元回补RDE-4是否可以改变生殖细胞中的siRNAs。 为探究神经元小RNAs对生殖细胞及子代的影响，作者通过四种互补的方法证明了回补的red-4未在生殖细胞中错误表达，确定了检测到的遗传影响均是由体细胞导致的。对生殖腺STGs（GermSTGs）和mRNA测序，发现1287个GermSTGs受到神经元RDE-4表达的影响，全虫测序表明189个STGs能遗传至F3代。HRDE-1和CSR-1存在于生殖细胞中，与内源siRNAs相关并发挥相反的调控功能。其中，HRDE-1负责dsRNA诱导RNAi和内源siRNAs水平变化的代际遗传，以响应饥饿和高温等环境变化；CSR-1则会抑制生殖细胞基因的沉默和表达调控。作者发现可遗传的STGs富含HRDE-1结合型，而缺乏CSR-1结合型。 进一步分析在神经元RDE-4回补的条件下生殖腺mRNA测序数据，发现在124个生殖细胞差异表达的基因中，40个（即32%）均靶向GermSTGs，能够调节广泛表达基因的转录率。在这些基因中，作者发现7个组蛋白基因，能够在神经元表达RDE-4后提升STG和mRNA水平。GermSTGs能够调控5个基因的代际遗传直至F3代，包括his-46，his-61，his-63，Y102A5C.5和saeg-2。由于saeg-2的RDE-4依赖性STGs在分离的神经元中同样含量丰富，作者选择对saeg-2的调控进行深入研究。首先通过单分子荧光原位杂交技术（single molecule fluorescent in situ hybridization, smFISH）验证了mRNA测序结果，发现在神经系统中回补rde-4，会导致saeg-2在生殖细胞中表达下调，并具有代际遗传现象。神经元RDE-4对生殖细胞saeg-2的调控依赖于hrde-1，进一步说明了saeg-2受到生殖细胞遗传的anti-saeg-2小RNAs的代际调控。此外，C18D4.6和C55C3.3生殖细胞mRNAs同样存在代际调控现象，其调控也受到hrde-1影响。这些基因中，仅C55C3.3的生殖细胞调控显著依赖于跨膜RNA转运蛋白SID-1。作者推测，其它内源siRNAs可能利用不同转运蛋白进行运输，或者神经元RDE-4对生殖细胞内源siRNAs的显著影响是由神经元分泌的其它信号分子触发的。 随后，作者对8个小RNAs突变体的趋化能力进行了检测，发现只有rde-4突变体在25℃培育下表现出趋化性缺陷，神经rde-4表达能够部分回补rde-4突变体趋化能力的缺陷。值得注意的是，hrde-1单独突变体不表现趋化性缺陷，hrde-1可以通过神经元RDE-4回补趋化性缺陷，表明神经RDE-4通过控制生殖细胞小RNA活性和对生殖细胞中表达基因的调控，以控制趋化行为。更为重要的是，作者发现RDE-4能够以跨代的方式影响趋化性，且母本RDE-4跨代回补趋化性的能力存在hrde-1依赖性。 已有研究证明eaeg-2能够影响线虫的行为【6】，通过CRISPR/CAS9构建rde-4;saeg-2双突变体，作者发现在rde-4突变体中敲除saeg-2能够回补突变体趋化行为的缺陷，由于缺乏神经元RDE-4，内源siRNAs不能靶向saeg-2，saeg-2 mRNA在生殖细胞中大量上调。尽管SID-1不影响saeg-2，但由于saeg-2的失调不能解释rde-4突变体全部的趋化性缺陷，因此作者检测了SID-1是否影响趋化性，结果发现神经元RDE-4对行为的调控受到SID-1影响，且sid-1突变体中神经元RDE-4回补子代趋化活动的可遗传能力更易发生变化。SID-1能在来源于rde-4（+/-）F0代和pan-neuronal Psng-1::rde-4（+/-）F0代的F3代rde-4（-/-）突变体中提高遗传行为的一致性。 图2 神经元RDE-4依赖性小RNA对子代线虫趋化行为的调节机制 综上所述，神经元RDE-4通过调节生殖细胞中的Argonaute HRDE-1，能够调控至少三代线虫的趋化行为；此外，神经元RDE-4还能够在生殖细胞中通过沉默saeg-2表达，部分回补red-4突变体的趋化性缺陷（图2）。SID-1同样能促进RDE-4回补趋化性的功能，这可能是通过影响saeg-2之外的基因表达来实现的。线虫体内合成的神经小RNAs能通过对生殖细胞中表达基因的调节，来实现对子代线虫趋化行为的控制。总而言之，本研究发现神经元对外部刺激或内部生理变化的反应可以转化为可遗传的信息，进而后代的行为。 原文链接： https:///10.1016/j.cell.2019.04.029 制版人：珂 参考文献 1. Stubbe, H. (1972). History of Genetics: From Prehistoric Times to the Rediscovery of Mendel’s Laws (MIT Press). 2. Weismann, A. (1891). Essays Upon Heredity and Kindred Biological Problems (Oxford Clarendon Press). 3. Weaver, I.C.G., Cervoni, N., Champagne, F.A., D’Alessio, A.C., Sharma, S., Seckl, J.R., Dymov, S., Szyf, M., and Meaney, M.J. (2004). Epigenetic programming by maternal behavior. Nat. Neurosci. 7, 847–854. 4. Vassoler, F.M., White, S.L., Schmidt, H.D., Sadri-Vakili, G., and Pierce, R.C. (2013). Epigenetic inheritance of a cocaine-resistance phenotype. Nat. Neurosci. 16, 42–47. 5. Vasale, J.J., Gu, W., Thivierge, C., Batista, P.J., Claycomb, J.M., Youngman, E.M., Duchaine, T.F., Mello, C.C., and Conte, D., Jr. (2010). Sequential rounds of RNA-dependent RNA transcription drive endogenous small-RNA biogenesis in the ERGO-1/Argonaute pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107, 3582–3587. 6. Hao, Y., Xu, N., Box, A.C., Schaefer, L., Kannan, K., Zhang, Y., Florens, L., Seidel, C., Washburn, M.P., Wiegraebe, W., and Mak, H.Y. (2011). Nuclear cGMP-Dependent Kinase Regulates Gene Expression via Activity-Dependent Recruitment of a Conserved Histone Deacetylase Complex. PLoS Genet. 7, e1002065. |
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