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第三代DNA测序技术 第三代DNA测序技术和前两代相比，它们最大的特点就是可以实现单分子测序，在对于那些稀有样品的测序方面具有无可替代的优势。 目前开发的第三代测序技术包括Helicos公司的Heliscope测序技术、 Pacific Biosciences公司的SMRT测序技术、Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔单分子测序技术，它们的具体原理不同，但它们都具有单分子测序的特点，即样品无需提前扩增，无需荧光标记，读长更长，后期数据处理更加方便。下面分别对这几种技术进行简单介绍： Helicos公司的 Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思路，其测序模板的制备吸纳了第二代测序技术的方法。将待测DNA片段随机打断成小片段并在3‘端加上poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记，然后将小片段与表面带有寡聚poly(T)的平板杂交，从而将测序模板固定在平板上。测序时，加入DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反应，每一轮反应加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱。检测每一步延伸反应是否有荧光信号，如果有则说明该位置上结合了所加入的这种dNTP。然后，用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反应。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。 Biosciences公司的SMRT技术也是基于边合成边测序的思路，以SMRT芯片为测序载体进行测序反应。 SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔、厚度为100mm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反应。 与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。其他未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前,这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物( nluoropolyr)切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。 SMRT技术的测序速度很快，利用这种技术测序速度可以达到每秒10个碱基。 SMRT测序技术示意图 Oxford Nanopore Technologies公司研制的纳米孔单分子测序技术是一种基于电信号测序的技术。该技术以α一溶血素为材料制作出纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精，用核酸外切酶切割单链DNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电度的变化幅度就成为每种碱基的特征。 由于每次只测定一个核苷酸，因此很容易解决同聚物的长度测量问题，但该技术仍在研发阶段，面临的两大问题是寻找合适的外切酶载体和承载纳米孔平台的材料。 纳米孔单分子测序技术示意图 |
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