|
1 RNase R反应体系 相关文章方法描述里RNase R的使用量和反应体系颇有不同，从1U-4U RNase R/μg RNA不等，下图是一个推荐的反应体系。  图1 RNase R消化反应体系（吉赛生物） 2 circRNA的鉴定 circRNA的鉴定或验证常使用RT-PCR和Northern blot实验，根据RNase R(+)和RNase R(-)组中是否检测到条带来证明检测的分子是circRNA。 RT-PCR中若要证明检测的基因是circRNA，需要体现在RNase R(+)和RNase R(-)组中条带有无或丰度高低有差异，也可以和分别使用Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA和gDNA样品的结果结合起来。  图2 使用RT-PCR检测mRNA，在RNase R(-)中有条带，在RNase R(+)中无条带；检测Lariat/Circular RNA，在RNase R(-)和RNase R(+)样品中都有条带，表明mRNA被消化，而Lariat/Circular RNA耐受消化（Suzuki H et al., 2006）  图3 RNase R消化后分别以Divergent Primer和Convergent Primer检测cDNA样品。RNase R(+)中Divergent Primer有条带，Convergent Primer无条带；RNase R(-)中Divergent Primer和Convergent Primer都有条带，表明检测的基因为circRNA，并且耐受RNase R消化（Yibing Y et al., 2018） Northern blot实验使用探针特异性检测内源的circRNA和线性RNA，过程中无PCR扩增，能够真实地反映circRNA和线性RNA的定性定量分析结果，是circRNA鉴定中必不可少的一个实验。  图4 以3U RNase R/µg RNA 进行RNase R消化15分钟，电泳显示RNase R(+)组中28S/18S条带变淡。使用同时检测circRNA和mRNA的探针进行Northern blot实验，结果显示RNase R(+)组检测不到线性的Gapdh、Phf21a、Elf2、Mfsd6、Stau2或Zfp609，可以检测到对应的circRNA，表明mRNA被消化，而circRNA耐受消化（Rybak-Wolf, A. et al., 2015）  图5 RNase R消化产物电泳显示RNase R(+)组中28S/18S/5S条带变淡。Northern blot检测显示RNase R(+)组中无线性GAPDH的条带，CDR1as和hsa-circRNA 2/3/16能检测到条带，表明线性RNA被消化，而circRNA耐受消化（Memczak S et al., 2013） 3 circRNA的富集 高通量测序时常需要使用RNase R对circRNA进行富集，为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。测序显示RNase R(+)组中junction reads相对于RNase R(-)样本一般有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs。  图6 RNase R(+)和RNase R(-) RNA测序示意图（Jeck WR et al., 2014） 4 RNase R消化实验结果 Total RNA经消化后直接进行电泳检测，RNase R(-)组中28S/18S/5S三条带单一明亮，而RNase R(+)组中28S/18S/5S条带会变淡或不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006）。但如果RNase R+组中5S条带加亮，且28S/18S条带处有拖尾，则可能是RNA被外源RNA酶降解，而不是RNase R消化产生的。  图7 a, RNase R消化后条带变淡；b, RNase R消化后条带不可见（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Suzuki H et al., 2006） 5 Q&As 5.1 测量浓度 实验中要先对total RNA测量浓度，以计算相应的比例和使用量来进行RNase R消化。消化后的反应液无需测量浓度，实际上因为反应体系内的蛋白质、盐离子等成分影响，测量到的浓度也不会准确。 5.2 纯化回收 经RNase R消化后富集的circRNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇溶液、RNA纯化柱或磁珠进行纯化回收，没条件的也可以直接使用TRIzol LS Reagent。经RNase R消化后直接进行RT-PCR的，一般可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可（Legnini I et al., 2017; Guarnerio J et al., 2016; Cheng ZF et al., 2002）。 5.3 RNase R消化反应温度和时间 RNase R消化一般于37℃进行反应，时间10-30 min为宜（Memczak S et al., 2013; Legnini I et al., 2017），不推荐过长时间的消化。另外检测不同的基因可能需要摸索反应时间，湖人实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。 5.4 qPCR定量计算 RNase R消化后不能再使用ACTB或GAPDH作为内参，此时可以将原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（RNase R(+)），另一份不处理（RNase R(-)），统一以RNase R(-)组中的内参为计算标准（Zhang Y et al., 2016; Panda AC et al., 2018）。 另外在RNase R消化后如果进行纯化回收，RNA的浓度可能会有变化，不适宜再以RNase R(-)组中的内参为计算标准。此时可以在纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算（Rybak-Wolf, A. et al., 2015; Pamudurti NR et al., 2017）。 5.5 circRNA也被消化？ 实验中有时会发现经RNase R消化后部分circRNA丰度也有明显降低，此时要检查消化反应体系有无问题，考虑是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA经长时间RNase R消化后丰度也会降低，可能是因为其耐受RNase R消化力弱（Zhang Y et al., 2016）。  图8 RNase R消化0-120 min，Northern blot检测显示circCAMSAP1在15 min时就明显被消化（Zhang Y et al., 2016）  图9 RNase R消化后进行qPCR检测，RNase R组中has-circRNA 2/3/6/9/16和CDR1as丰度有轻微降低，但和GAPDH相比，circRNAs显示有超过10倍的耐受RNase R消化力（Memczak S et al., 2013） 湖人实验室也经常会检测到RNase R消化后circRNA丰度会降低的情况，一般缩短消化时间可以减少circRNA被消化的可能，另外对比线性RNA和circRNA消化后丰度降低的倍数，是明显能看到circRNA比线性RNA耐受消化的。 5.6 线性RNA消化不完全？ 实验中经常发现经RNase R消化后做RT-PCR依然能检测到线性RNA的条带，总要怀疑是消化不够彻底或消化体系不合适。但其实这种情况是正常的，因为在限定RNase R用量和反应时间的条件下，底物中线性RNA很难被彻底消化，而增加RNase R用量或反应时间又可能导致部分circRNA被消化，因此在固定体系中平衡反应时间是很有必要的。另外注意以半定量PCR的思路，统一PCR扩增条件和循环次数，电泳检测也可能得到理想的结果图。如果RNase R消化后circRNA丰度不变或轻微降低（RT-PCR检测条带基本不变），而线性RNA丰度明显降低（RT-PCR检测条带变淡或不可见），这样的结果也是符合预期的。  图10 RNase R消化后进行PCR检测，与RNase R(-)组相比，RNase R(+)组中linear mRNA条带变淡，表明被消化；RNase R(+)组中ci-ankrd52和circCAMSAP1条带变亮，表明被富集（Zhang Y et al., 2016） |
|
|
