果子导读：如果做基础实验，分子克隆是必不可少的。分子克隆的步骤很多，如果想要学习的话，一定要找一个会做的团队，完整地看几次才行，不建议自学。 要说分子克隆中最困难的步骤，大家可能想不到，是PCR，这里的PCR的目的是为了获取目的条带，最终连入质粒内。PCR的引物设计很重要，在那之前，豆子老师给大家准备了一期普通qPCR的引物设计来热身。 以下是今天的正文。这期来探讨一下引物设计，由于做基因合成需要加保护碱基以及酶切位点，可能刚开始不是特别好理解，所以我们先来探讨一下普通qPCR的引物设计，这样可以让我们对引物设计先有一个大概的了解，先了解在线设计引物以及设计引物时的注意事项，然后再来探讨一下可以设计引物的软件以及blast，最后来看一下启动子引物的设计。 先以CYLD用NCBI在线设计一下引物： 如果你不想了解那么多，那么这段也够了，在你目的基因中点击Pick Primers（怎么找在前面已经探讨过），大多参数在Primer designing tool中已经预设好了，我们只需要调整PCR产物大小50-250、引物Tm值（不用调整）、物种（你已经选择）以及在Advanced parameters中将Max Poly-X设置为3，点击“Get Primers”，即可等待结果的出现了。 接下来就是详细步骤及为何如此选择的原因，从NCBI找到基因前面的步骤我们之前已经探讨过，直接到目的就可以看到右边  点击Pick Primers，进入引物设计页面  可以看到PCR Template栏中会出现其对应编号：NM_015247.2，如果你已经有序列，可以在框中直接粘贴你的序列。在右侧的Range栏中，可以设定正反向引物的结合范围。  再往下拉就是引物参数栏，前两行是引物的序列栏，如果你已经有引物那么就可以进行特异性分析，但是在引物设计的过程中并不会用到，不要管就行。在PCR product size一行中，可以设定PCR引物的扩增产物长度范围，对于qPCR来讲，范围设为50-250时结果比较精确，可以先设定一个较小的范围，如80-150，如果该范围内没有设计出比较好的引物，则可以返回扩大产物大小范围。of primers to return是指软件设计引物的数量默认为10对，如果引物少于10对时，有几对就会显示几对。引物的Tm值一行中，可以设定引物的最大Max、最小Min和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最大差值difference。对于qPCR来讲，最佳Tm值60℃，不需做任何修改。  大家都知道真核生物的基因组由内含子和外显子组成，而成熟的mRNA仅包含外显子而没有内含子，因此在设计qPCR引物时，经常会选用跨外显子（是外显子-外显子，而不是内含子-外显子）的方法进行设计，从而保证该引物不会对基因组DNA进行扩增，这时候肯定在思考我们提的是RNA，为什么会对基因组DNA进行扩增，因为在提RNA的过程中，虽然可以进行处理将RNA样本中的DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全，而样本中的基因组DNA会显著影响最终的结果。 在Primer Design Tool中第一行有三个不同的选项，分别代表：对跨外显子无要求、一对引物中至少一条一定要跨外显子以及引物可以不跨外显子。要注意，选择后两项时，PCR模板栏中必须要填写NCBI中序列的登录号，如mRNA的NM号，以便于程序识别其中的外显子拼接位点。如果手动粘贴序列，则会因为无法定位外显子而设计失败。  再往下拉就是针对引物特异性检测的。引物特异性就是保证在扩增过程中只扩增出目的片段。要确保最上面一栏中打勾。Search mode一般选择Automatic即可，因为如果输入为序列时，就会发现你所输入的序列可能在好几个变体中都会存在，在比对的数据库中就会显示出来，你就可以选择需要检测的PCR模板。Database是指特异性检测所用到的数据库：对于常用的检测基因表达上下调变化，一般选择Refseq mRNA，因为此时PCR模板是mRNA的逆转录产物；若要检测lncRNA，该数据库就应该选择覆盖面更广的Refseq RNA。若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。Organism是指样本所属物种，将物种名称选择候选栏中对应的物种即可。也可以直接输入物种ID (常用的如：人9606，小鼠10090，大鼠10114)。在Organism下方，可以对特异性要求的严格程度进行设置，比如引物对非特异结合位置至少要有几个不匹配碱基等。在Allow splice varians一栏中，我们可以勾选上，使得引物为基因特异，即能与该基因的多个转录变体结合。但需要注意的是，该选项只能保证设计出的引物可以结合多个转录变体，但并不能保证所有的转录变体都能检测到。 在Advanced parameters中，我们可以进一步对引物的参数信息进行调整，如特异性检测参数、引物长度、GC含量范围，一般将Max Poly-X设置为3，即引物中不能出现超过三个以上连续相同碱基，点“Get Primers”，就可以得到如下：  这就是我们得到的引物，每个引物的详细信息都可以看到。 上面只是让大家对引物设计简单的了解一下以及看一下其中出现的一些参数，接下来我们就对引物设计里面的参数以及需要注意的方面进一步来探讨一下： （1）引物长度 （2）引物碱基 PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所需要放大的模板GC/AT比。GC含量一般为40-60%为宜，以45-55%为宜，过高过低都不利于扩增。GC含量太少导致引物的Tm值较低，不利于PCR特异性，GC含量过高易出现非特异扩增。引物中四种碱基最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列如GGGGG等，也不要出现二核苷酸重复序列，如GCGCGC等。上下游引物的GC含量不要相差太大。附加序列加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们。引物对的Tm差异不超过5℃，设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记不管如何设计的引物都要BLAST，这个我们后面就会涉及到，如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。 （3）引物Tm值 DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。一般要求：55℃-65℃。对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算。对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式Tm = △H/(△S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+]))-273.15，一般软件都会自带有Tm值，所以不要担心。 （4）引物的二级结构 引物的3’端序列比5’端重要，在3’端的碱基尽量不要用A或AA以及AAAA。。。因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，3’端碱基最好为G或C但不要超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发，5’端序列对PCR影响较小，同时3’端不要终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位容易发生简并，会影响扩增的特异性和效率。 引物之间出现的配对能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，特别是3'端的互补问题会更为严重，3’末端配对很容易引起引物二聚体扩增。它会使引物二聚体扩增而减少目的扩增，由于引物二聚体的能值过高（超过4.5kcal/mol），不仅可能产生非特异的扩增条带，而且可能通过降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成,引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应，仅仅需要三个连续碱基配对。发卡结构的稳定性可以用自由能衡量,自由能大小取决于碱基配对释放的量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0则该结构不稳定，从而不会干扰反应。如果自由能值小于0 则该结构可以干扰反应，发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 错配：如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现错配。3’末端连续几个碱基配对形成错配的可能性要更大，所以引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。在使用引物设计软件时，引物在模板内一定具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。引物设计好后，最好做blast检测，检查同一物种基因组中是否存在高度同源序列。 （5）引物的保存 引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温最多可以保存2个月。 几种设计引物的软件，先有个印象，以后我们会慢慢熟悉Primer Premier,Oligo,DNAstar,Beacon Designer以及一些在线的等等。 |
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