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张玲，叶海波，时海波 (上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科，上海交通大学耳鼻咽喉科研究所，上海东方耳鼻咽喉科研究所，上海，200033) 【引用本文】张玲,叶海波,时海波.胆红素所致听觉系统神经损害的新机制.山东大学耳鼻喉眼学报，2019，33（3）：33-37. 时海波教授 ●医学博士，主任医师，教授，博士生导师。现任上海交通大学附属第六人民医院耳鼻咽喉头颈外科常务副主任，教研室主任。 ●主要学术任职：中华医学会耳鼻咽喉头颈外科学分会中青年委员会副主任委员，上海市医学会耳鼻咽喉头颈外科专科分会委员兼耳科学组副组长，中国中西医结合学会耳鼻咽喉科专业委员会眩晕专家委员会副主任委员，上海市声学学会生理学组主任委员。1995年毕业于南京医科大学临床医学系眼耳鼻喉专业，在第一附属医院（江苏省人民医院）耳鼻咽喉科工作，2003年获南京医科大学耳鼻咽喉科学硕士学位。 ●研究方向：长期从事耳鼻咽喉科学的医、教、研工作，曾赴美国HEI进修耳科专业。致力于耳科疾病诊治，尤其是耳显微外科手术以及耳聋、耳鸣、耳源性眩晕等临床诊治及研究。 摘要 严重高胆红素血症（黄疸）可导致特定神经系统的功能损害，具有神经核团选择性、新生儿期易感性等临床特征。听觉神经系统对胆红素毒性高度敏感，临床表现为最早出现的、或者是唯一显症的急性功能损害，或者是隐匿的、成年期显症的听神经病谱系障碍。临床及基础领域的零散研究表明，兴奋毒性是胆红素诱发神经功能障碍的主要途径，但听觉障碍特征及损害机制均未明确。听觉环路电信号的产生及传导，有赖于神经元动作电位的节律形成，以及电信号在神经纤维的同步化传导。适度兴奋性是维系正常听觉的基础，但“癫痫样”过度兴奋将导致细胞能量代谢紊乱，细胞内Ca2 增多，最终导致细胞凋亡或坏死。探索胆红素所致听觉神经毒性机制的研究，不仅有助于揭示听觉环路病理生理特征，也有助于揭示胆红素脑病的发生机制及拮抗措施。 超过七成的新生儿出现高胆红素血症（黄疸），严重者可出现特定中枢核团的功能损害，包括脑干听觉核团、前庭核、下丘核、海马和小脑浦肯野细胞等症状。早在上世纪50年代人们就已经认识到，幼年期的听觉中枢对胆红素神经毒性高度敏感，甚至在“生理性黄疸”状态下也可出现听力损害，表现为急性或缓慢显症的感音神经性聋。在新生儿重症监护病房和母婴同室的新生儿中，高胆红素血症都是其感音神经性听力障碍发生的主要高危因素。过半数的听神经病谱系障碍患者具有明确的新生儿期严重黄疸病史，提示胆红素对听觉神经发育的长期损害。虽然学术界广泛认同新生儿期高胆红素血症容易导致听觉损伤，但其听觉损害特征、中枢神经毒性机制、幼年易感机制等尚未明确，使得临床缺乏针对性的防治药物。近十余年来，笔者所在团队开展了系列研究，对上述问题进行了初步诠释。 1 胆红素所致听觉损害特征 1.1电生理特征 1.1.1听性脑干反应 听性脑干反应( auditory brainstem response, ABR)主要反映听觉初级神经元至脑干听觉核团的神经电活动，通过测定ABR的波潜伏期和波间期有助于评估听觉通路兴奋性及同步化状况。ABR作为一项客观检查，具有快速、方便、敏感性和特异性高等优点，已成为目前临床婴幼儿听力联合筛查的常规检查之一。我们采用单次腹腔注射胆红素的方法，制作了一过性的高胆红素血症豚鼠模型（生后5~7日豚鼠幼崽，下同），动态监测了ABR各指标在高胆红素血症发生、发展过程中的变化。通过对完全清醒状态下的动物进行ABR测试发现，高胆红素血症可以显著影响ABR，表现为ABR波Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ潜伏期延长，Ⅰ-Ⅱ波间期、Ⅰ-Ⅲ波间期延长，ABR阈值升高。上述指标的异常程度，均与动物的神经行为学评分存在正相关，提示ABR可用于临床评估胆红素神经毒性的严重程度。 1.1.2耳声发射 耳声发射( otoacoustic emission, OAE)可用于评估耳蜗外毛细胞的功能状态。对于高胆红素血症时耳蜗是否易于受累，学术界一直存在争论。普遍的观点认为高胆红素血症不影响耳蜗的功能，损害部位主要在蜗后。但我们的研究结果证实，高胆红素血症豚鼠各频率的畸变产物耳声发射(distortion product otoacoustic emissions, DPOAE)振幅下降，但始终可以引出，且随着高胆红素血症的的消退而恢复，说明胆红素可以损害耳蜗毛细胞耗能的主动机械活动。 1.1.3耳蜗电图 耳蜗电图(electrocochleography, ECochG)主要包括三个成分，耳蜗微音电位（cochlear microphonics，CM）、听神经复合动作电位( compound action potential, CAP)和总和电位( summating potential, SP)。CM和SP来自毛细胞, 都是感受器电位。CM主要反映外毛细胞功能(占80%)，部分反映内毛细胞功能(占20%)；CAP是许多听神经单纤维的动作电位叠加的结果，是反映听神经同步化的重要指标；SP是感受器细胞直流响应的反映，与内毛细胞关系密切。我们的实验结果显示在2kHz和8kHz，无论是对照组还是高胆红素血症动物的CM振幅均没有显著变化。CAP则出现显著异常：高胆红素血症组1kHz、8kHz、32kHz在给药后8h出现CAP N1潜伏期延长；与神经行为学评分一致的是，72h完全恢复到最初水平；在给药后24h出现各频率CAP振幅下降，72h振幅恢复至最初水平，但与对照组相比，CAP振幅存在发育滞后现象。结合前述试验，我们发现胆红素主要损害听神经信号传导的同步化，而非毛细胞功能。 1.2形态学特征 我们通过对毛细胞、缰孔神经纤维及螺旋神经节神经元（spiral ganglion neurons）等的显微、超微结构的定性、定量的形态学观察，揭示了胆红素所致听觉外周与中枢的病理损害特征。高胆红素血症组给药8h和10d后，耳蜗基底膜铺片及毛细胞计数均无异常，提示胆红素毒性并不导致内外毛细胞的死亡。 然而在给药8h的高胆红素血症组，电镜观察到内毛细胞（inner hair cell，IHC）底部的I型传入神经末梢显著损害，甚至呈现完全毁损；给药10d后，IHC底部的I型传入神经末梢恢复正常，与对照组动物无明显差异，IHC线粒体结构保持正常。该研究提示了I型传入神经末梢损害的自我修复可能，提示了临床早期治疗的重要性。 高胆红素血症组在给药8h后，螺旋神经节神经元的数量未见减少，但周围突和中枢突的神经鞘膜均出现了大量空泡，神经纤维结构基本保持正常，而且耳蜗底回的听神经纤维数量明显减少。在给药后10d，对应于电生理指标的基本恢复正常，听神经鞘膜空泡消失、结构基本恢复；听神经纤维数量基本恢复，但仍少于对照组。我们还在激光共聚焦显微镜下观察到，腹侧耳蜗核（ventral cochlear nucleus，VCN）和下丘（inferior colliculus，IC）内神经元发生了凋亡，证实了胆红素的中枢神经元损伤（未发表数据）。 2 胆红素中枢神经兴奋毒性机制 既往研究提示，胆红素神经毒性涉及细胞内的钙超载、线粒体受损等多种途径。虽然具体机制不明，但神经兴奋毒性被确定是其关键环节。胆红素可能损害细胞膜功能，继而影响神经元兴奋性，也可能破坏线粒体功能，导致其内钙释放、增加细胞内Ca2 浓度。Ca2 作为细胞内的重要第二信使，可激活多种蛋白酶系统，促使细胞凋亡或坏死。 2.1胆红素通过促进谷氨酸能突触传递引起听觉核团神经元超兴奋 谷氨酸能突触传递是主要的兴奋性传入，但既往研究提示谷氨酸受体并不参与胆红素兴奋毒性。我们使用短杆菌肽穿孔膜片钳技术，分离出生后11~14d（P11~14）大鼠的上橄榄外侧核（lateral nucleus of superior olivary, LSO）神经元，记录其自发性兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs），发现胆红素显著上调突触前体的谷氨酸释放几率，诱发突触后AMPA和NMDA受体开放，导致神经元过度兴奋。该研究结果首次确定谷氨酸能突触传递参与胆红素兴奋毒性，纠正了既往的认识。 2.2胆红素上调胞内游离钙离子浓度([Ca2 ]) 2.2.1胆红素激活谷氨酸通路、诱发胞内Ca2 超载 谷氨酸受体开放后，Na 、K 、Ca2 等阳离子跨膜进入神经元，突触后膜去极化，诱发神经元动作电位。我们采用钙指示剂Rhod-2-AM荧光强度测定，观察VCN神经元内Ca2 浓度的大小及改变。结果显示，在胆红素(3μM)作用20min后VCN神经元荧光强度显著增加，提示神经元[Ca2 ]水平升高。谷氨酸受体阻滞剂NBQX、APV 联合作用时，则完全抑制了胆红素升高VCN神经元[Ca2 ]的作用，提示胆红素效应是 NMDA和AMPA谷氨酸受体所介导。 2.2.2胆红素促进VGCC的开放上调[Ca2 ] 除了谷氨酸受体之外，细胞外Ca2 流入细胞的主要途径还包括电压门控Ca2 通道（voltage-gated calcium channels，VGCC），其是否受到胆红素影响尚属未知。我们通过对出生后大鼠幼仔（P4-17）VCN中的丛细胞（bushy cell）进行电压钳记录，证实胆红素剂量依赖性地增强VGCC介导的Ca2 电流，引起过量Ca2 内流，扰乱细胞内的Ca2 稳态平衡，导致神经元损伤。 2.3胆红素促进听觉神经元自发性内源性放电的发放 自发性电活动对整个听觉通路的形成及完善发挥重要的作用，但该种自发性电活动产生的机制及其是否在胆红素兴奋性毒性中发挥作用尚不清楚。我们通过实验证实了听觉中枢神经元自发性内源性放电的存在，并且发现HCN通道在自发性内源性放电的产生机制中起主导作用。进一步的实验发现胆红素可以促进听觉神经元自发性内源性放电的频率，同时，胆红素可以直接促进HCN通道的开放，上述结果提示自发性内源性放电参与了胆红素兴奋毒性机制。 3 发育早期神经中枢的胆红素毒性易感机制 相比较成人而言，新生儿的神经中枢特别容易受到胆红素神经毒性的影响，出现不同程度的胆红素脑病、甚至死亡，但其易感机制不明。我们探索了神经元在不同发育时期的生理性差异，以期揭示病理机制。 3.1胆红素促进发育早期、去极化效应的GABA/甘氨酸能突触传递 GABA和甘氨酸是成年期哺乳动物中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，其受体通过介导氯离子内流而发挥超极化作用。针对成年动物，我们既往研究证实了胆红素对脑干核团GABA/甘氨酸突触传递的促进作用，但此现象不能解释胆红素的兴奋毒性作用。有研究表明在橄榄核神经元，GABA/甘氨酸受体的效应在未成年期可表现为兴奋作用。我们首先证实了发育过程中，VCN神经元同样存在GABA/甘氨酸效应的逆转现象，胆红素可以显著增加GABA /甘氨酸受体介导的突触后电流的频率；使用GABA /甘氨酸受体拮抗剂，可以消除胆红素诱导的P2~6神经元过度兴奋，但增加了P15~19神经元的自发性放电频率。上述研究证明，在出生早期VCN神经元，GABA /甘氨酸能突触传递表现为兴奋性的电生理效应，胆红素对其、以及对兴奋性谷氨酸突触传递的促进作用产生了协同的超兴奋效应，从而部分解释了胆红素的发育早期神经易感机制。 3.2胆红素特异性增强P/Q亚型钙离子通道开放 VGCC通道可分为T、L、N、P/Q和R五种类型，在不同发育阶段各亚型的比重发生改变。令人惊讶的是，胆红素特异性增强VCN神经元P/Q型、而非其他类型VGCC通道的活性，诱发显著增强的钙离子内流；同时，P/Q亚型钙通道在发育早期VCN神经元中占比最大、成年期占比则较少。因此我们推断，胆红素特异性增强P/Q型钙电流可能也参与了胆红素神经毒性的发育早期易感机制。 3.3胆红素促进发育早期自发性内源性放电频率 自发性内源性放电在P1~4动物中就已出现并且胆红素对该时间段的神经元毒性更加明显。我们通过实验发现，在P1~4和P15~19动物中，胆红素都可以促进听觉神经元自发性内源性放电的频率，但随着年龄的增大，胆红素对放电频率的增加幅度越来越小。因此我们推断自发性内源性放电可能也是胆红素脑病早期易感性的基础。 4 胆红素神经毒性拮抗药物的探索 目前，临床上对高胆红素血症患儿主要采取蓝光照射及换血疗法，主要目的在于消黄，存在一定的滞后性与被动性，临床缺乏有效防治药物。我们探讨了牛磺酸，利鲁唑和NAD 对胆红素神经毒性的拮抗作用。 4.1牛磺酸拮抗胆红素所致听神经损伤 牛磺酸是哺乳动物中枢神经系统中最丰富的内源性氨基酸之一，参与中枢神经系统的发育和许多生理过程。我们的实验结果发现，牛磺酸能减轻胆红素在听觉系统引起的ECochG和ABR的潜伏期延长、波间距延长和阈值增加，减轻胆红素诱发的I型SGNs的脱髓鞘反应。虽然胆红素可显著增加SD大鼠VCN神经元sEPSCs和动作电位的发放频率，但此种超兴奋作用可被牛磺酸拮抗；GABA/甘氨酸受体阻滞剂可以消除牛磺酸的神经保护作用，提示牛磺酸通过激活氯离子内流而发挥保护作用。 4.2利鲁唑拮抗胆红素所致神经毒性 利鲁唑是1995年获批准用于治疗神经变性疾病肌萎缩侧索硬化症的临床处方药物，拮抗谷氨酸所致兴奋毒性是其主要作用机制。我们探索了利鲁唑对谷氨酸能突触传递、神经元兴奋性以及胆红素引起的神经元超兴奋性的影响，发现利鲁唑能显著减少大鼠VCN神经元sEPSCs以及动作电位的频率，但并不影响其幅度；提前或稍后使用利鲁唑，均能显著抑制胆红素所致sEPSCs 及动作电位频率的增加、拮抗胞内Ca2 超载以及神经元的凋亡和坏死，证实利鲁唑可以抑制胆红素神经兴奋毒性。 4.3 NAD 拮抗胆红素所致神经毒性 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD ）是一种重要的小分子物质，参与细胞能量代谢、钙离子平衡、免疫及基因表达等多种生理活动。尽管NAD 在细胞的生物学功能上发挥重要作用，但还没有人关注NAD 对神经元兴奋性的作用及其对兴奋性毒性的保护作用。我们观察了NAD 对VCN神经元的影响，发现NAD 可以显著减小诱发性兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic currents, eEPSCs)，并逆转胆红素所致eEPSCs及mEPSCs频率增加；NAD 可以降低VCN神经元自发性放电的频率，拮抗胆红素诱发的放电频率增加。上述结果表明，NAD 通过抑制谷氨酸神经递质释放的途径，拮抗胆红素所致神经兴奋毒性。 5 展望 虽然胆红素神经毒性的研究已经取得了相当的进展，但胆红素对特定核团的选择性损害机制、胆红素脑病的远期后遗症等均亟待揭示。尤其在认识到胆红素神经毒性存在可逆性时，临床及时、有效的干预显得更为重要。目前依然缺乏针对性的防治药物，胆红素神经毒性仍严重威胁新生儿健康。进一步的深入研究，将为打破瓶颈提供坚实依据。 |
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