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去年冬天，朱冰与饶毅两位大牛关于“表观遗传及其在细胞命运决定中的作用”进行的辩论，引爆了学术圈的热烈围观！ 无论是出于专业研究的兴趣，还是熊熊燃烧的八卦之魂驱动，相信很多小伙伴当时都守在电脑前，过了把瘾吧？ 看门道也好，听热闹也罢，表观遗传学近几年取得的一系列研究进展，确实吸引着越来越多的关注！话说，关于表观遗传学，大家关心最多的问题，就是如何研究DNA甲基化，哪些技术适合我使用？今天我们就这些常见问题做一个解答。 核心点 1：什么是DNA甲基化？ 2：DNA甲基化起到的作用是什么？ 3：现在研究DNA甲基化的技术手段有哪些？各有什么优势和劣势？ 4：常规的分析方法及内容有哪些？ 什么是DNA甲基化 首先说第一个问题，DNA甲基化。 现在对甲基化的研究，总的来说大致可以分为三大类： --DNA甲基化，这一类是研究最多，修饰也最为稳定的类型； --组蛋白的甲基化修饰，以及乙酰化； --RNA甲基化修饰，虽然RNA的修饰有100多种，但主要以A碱基上的6mA甲基化修饰为主，现在关于此的研究也非常火。 今天我们重点聊一聊DNA的甲基化修饰。 那么，什么是DNA甲基化修饰呢？简单的讲，就是在DNA上胞嘧啶发生了一个甲基基团的修饰，有图有真相：
因此，提到DNA甲基化的时候，我们也会说5mC甲基化。别看这只是一个小小的改变，它所起到的作用却是巨大的！有些科学家甚至将DNA甲基化叫做“第五种碱基”！ DNA甲基化的作用 那么第二个问题就来了，这玩意儿有什么作用呢？ 简单来说，DNA甲基化可以调控基因的表达。以高等动物为例，每个个体从一个受精卵发育成成体的过程中，DNA甲基化都是不同的，会调控不同的细胞往不同的方向分化。比如，哪些细胞群变成大脑，哪些变成心脏，都和它有着密切的关系。 当然，受精过程中的重编程现象也是很大的一个课题，这里就不展开阐述了。 另外一个方面，当我们长大了，如在抑癌基因上某个区域的甲基化升高，就会导致基因的表达降低，进一步就会诱发癌症风险，反之，如果在致癌基因调控区域的DNA甲基化变低，也有可能导致癌症等各种疾病的发生。 在人以及各种哺乳动物中，很多C和G连续的碱基上会发生DNA甲基化，而与C相邻的其他碱基则不会，这种现象与DNA甲基化修饰酶有一定的关系。 在人的基因组上，有很多CG碱基聚集的地方，我们称之为CpG岛，这个地方往往是低甲基化的，如果甲基化发生了改变，就会导致后面的基因无法表达，进而就会有一系列问题了。所以在大量的文献中，CpG岛的甲基化修饰一直是研究重点。 现在又有了CpG 海岸的概念。啥意思呢？就是科学家们发现，除了CpG岛会出问题，岛旁边的位置也很容易发生改变！ 在很多研究中，大家都会关心DNA甲基化是不是导致基因表达变化了，而很多转录起始位置附近也会有CpG岛，所以我们也常常会把研究的焦点集中于转录起始位置的启动子区域（一般是转录起始位置上游2k，下游500bp的样子，当然不同研究中的定义略有不同）。 除了发现DNA甲基化会调控基因表达，也有发现表明，外显子和内含子的DNA甲基化异常也会导致不同的可变剪切，这也是一个重要的研究内容。 研究方法与技术手段 上面说了DNA甲基化的作用，接下来聊聊第三个问题：研究DNA甲基化的技术手段有哪些？ 简单的说，可以分为两大类。 一类是IP类的，代表作就是DNA甲基化免疫共沉淀技术（MeDIP-seq），当然还有专门富集CpG的MBD技术，不过研究的不多。 另外一类就是今天要说的重点内容：重亚硫酸盐处理技术。Bisulfite技术本身非常简单，就是把没有甲基化的C变成T，不过其延伸出来的技术种类五花八门，比如： --全基因组DNA甲基化技术（WGBS） --酶切全基因组甲基化技术（RRBS） --双酶切技术 --启动子液相捕获DNA甲基化芯片技术（LHC-BS） --精确DNA甲基化技术（oxBS） 另外，这里要重点说一下精确DNA甲基化技术。什么是精确？比如，在动物体内，DNA甲基化是一个动态变化的过程，不仅有DNA甲基化过程，也有TET酶参与的去甲基化过程。在去甲基化的过程中，甲基基团首先会被氧化成羟基，这个羟基在后续会进一步被氧化成醛基、羧基，然后就变成无官一身轻的胞嘧啶了。
重亚硫酸盐处理以后，醛基修饰的C，羧基修饰的C，还有没有甲基化的C全部都会变成胸腺嘧啶T。传统的bisulfite技术是无法区分甲基化和羟甲基化的，而精确DNA甲基化技术是通过某种重金属，把羟基给氧化了，这样后续处理的时候，也会变成T，而剩下的就只有甲基化胞嘧啶C了。所以通过这个技术，可以将羟甲基化单独拎出来研究。
目前，比较成熟的氧化甲基化技术（oxBS）是由CEGX公司推出的，该技术可以稳定的将羟甲基化修饰给氧化掉，最终经过bisulfite转化成T。 另外，科研界也有通过TET酶来研究精确甲基化和羟甲基化的，不过相关的酶在美国一家公司制造，订购起来并不方便，如果实验室没有自己生产TET酶的能力，建议还是先考虑oxBS。 说完了技术手段，接下来我们讨论一下各种技术的优劣式。 先说准确性。现在研究DNA甲基化，最准确的自然是重亚硫酸盐处理，这种手段可以精确的看到每个胞嘧啶位点上的甲基化修饰情况。对于经费充足的实验室，重亚硫酸盐处理技术中的WGBS技术是首选，此技术可以覆盖全基因组，一般要求30X，比如人的基因组差不多需要90G的数据量。考虑到测序成本，此技术更适合经费充足的实验室。 WGBS技术也适合某些做植物研究的实验室，比如，像黄瓜等基因组很小的物种（只有几百M），测序成本很低，就没有必要采用其他技术来做了。对于基因组大的植物物种，可以考虑用MeDIP，或者双酶切RRBS评估一下，是否可行。 对于精度要求更高的，比如只研究精确的DNA甲基化的修饰情况，或者是想研究羟甲基化的修饰情况，oxWGBS是首选，它的成本也相对比较高。此类技术的应用限制，现阶段来说就是测序成本较高。 其他研究定量甲基化的技术，都是只研究基因组上一部分的甲基化的修饰情况，代表技术有RRBS（基于酶切），LHC-BS（基于液相捕获），以及现在临床应用比较多的850k/450k甲基化芯片。 RRBS和LHC-BS是基于测序技术，研究的CpG位点数大概都是在2M左右，也是基于测序技术研究大规模样品常用的工具之一，数据量一般8-10G。 RRBS研究的区域是全基因组上的酶切位点，如RSPI酶的CCGG位点等。不过此类技术在现有读长PE150的背景下会浪费很多数据（因为有效的酶切区域片段为40-220bp，现有测序技术会被测通，从而导致大量数据被浪费）。 而LHC-BS的优势在于可以覆盖基因组上绝大多数的启动子区域（95%），全部的CG岛和CpG shore区域，但是对实验操作者的水平要求较高，一般捕获效率在50%-60%。此条件下，8G的数据量，在人的样品中目标区域60M，可得到的实际深度为50~60X，和BS技术对比吻合度也比较好，对现阶段大规模DNA甲基化样品研究而言，还是一个值得选择的工具了。 再有就是450k甲基化芯片和850k甲基化芯片，这两款芯片是基于荧光定量来鉴定DNA甲基化的，和测序的结果吻合度也较好，但问题在于检测位点数太少，且现阶段的成本也不便宜，与RRBS和LHC-BS相比成本也低不了太多。 说了这么多，大伙儿是不是有点晕？来，我们整个图，直观地展示一下这几种技术在各基因元件上的覆盖情况。
DNA甲基化的数据分析 下面我们就详细聊聊第四点，DNA甲基化数据分析的常规流程及工具。 针对DNA甲基化的数据分析，基本上是三步走（大家看到的各个公司提供的分析报告也基本如此）。 首先是质控。此步骤通常是过滤低质量的reads，一般测序结果为N占总reads数50%，或者低质量base数占总base数的50%会过滤掉。如果测序数据比较充足可以不用管这个部分的参数设置。 过滤完毕后，下一步就是比对了。这个部分是很消耗资源的。一般用的研究DNA甲基化的高通量测序软件主要有BSMAP、BS Seeker、bismark、SOCS-B、BRAT等，网上有人总结过这些软件，感兴趣的小伙伴可以自行查找一下。 个人比较推荐BSMAP，计算速度快，操作简单，自带的脚本也可以比较方便的计算出C位点的甲基化率（CG/CHG/CHH）。 第三步，也是比较重要的一步，就是找DMR或者DMS。常见的软件有MethMarker、metilene、eDMR等。上面这几款软件对于找DMR还是不错的，当然也可以自己写脚本来验证。 另外在高级分析方面，DNA甲基化的分析也可以结合SNP的结果。这方面的软件有BS-SNPer、bis-SNP等，各有优势，有的是基于GATK流程开发的，有的是基于SOAPSNP开发的，在速度和准确性方面各有千秋。 其他的分析如ASM，推荐amrfinder软件，这款软件现在整合到了methpipe中，感兴趣的小伙伴们都可以试试。另外对于如MeDIP类的技术，一般也是先过滤低质量reads，然后再比对，call peak。不过这里小编建议对于两组peak间最好求出组间的差异，对于后续分析还是蛮有用的。 这些流程走完了之后，后面基本上都是一些功能分析的内容了，可以根据各自不同的项目分别选用不同的工具，这里就不啰嗦了。 （文章转载自"克里克学院"公众号，已获作者授权） 金唯智全基因组甲基化测序(Whole genome methylation sequencing, WGBS)是以高通量测序平台为基础，结合重亚硫酸盐(Bisulfite) 处理方法，运用生物信息分析技术，对有参考基因组的物种在全基因组水平进行甲基化研究，是表观遗传学研究的重要方法。
关于金唯智 GENEWIZ（金唯智）成立于1999年，总部位于美国新泽西州，是专注于基因组研究和基因技术应用的生物高科技公司。金唯智在全球范围内为科学研究人员提供高通量测序、Sanger测序、基因合成、引物合成、分子生物学服务及GLP标准规范服务。基于金唯智严谨的科学和卓越的服务，包括近30位诺贝尔奖获得者在内的众多科研工作者已成为金唯智的忠实客户，全球诸多知名跨国公司以及著名高等学府也把金唯智选为其战略合作伙伴和首选供应商。 金唯智中国总部位于苏州，在北京、天津、广州设有公司。金唯智中国与分布在美国、英国、日本的十几个运营实验室组成了金唯智全球化的服务网络，为生命科学各领域客户提供优质高效，便捷快速的服务。经过金唯智人多年的努力，公司在多项领域已成为行业的标杆和领导者。 更多了解请访问：（基因编辑：www.genewiz.com.cn/Public/Services/GE） |
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