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在发展中国家的贫困地区，由于缺乏医疗设备，很多疾病的诊断只能依靠医疗工作者根据病人的症状进行估诊，往往延误了治疗。每年仍有多达五亿的疟疾患者由于未显示出病症而没能在感染早期被诊断出来，导致更多人被传染。因此，这些地区的居民亟需操作简单、廉价实用、可随身携带、无需辅助器材( 如电、泵、光学器件等) 的纸基器件检测常见疾病。纸基器件常用的检测方法有比色法、荧光法、化学发光法、电化学法、电化学发光法等。不同的检测方法可实现疾病的早期诊断以及食品质量检测和环境监测。因此，纸基器件的高检测速率、高选择性、高灵敏性，以及相对较低的成本和无污染优势，使其受到体外检测及相关应用检测的青睐。 然而，纸基器件检测仍存在一些问题，尚待突破。例如，如何提高纸基器件检测的多样性、稳定性、重复性以及检测设备的便携性等。在不同的检测方法中比色法是最直观、最常用的一种方法，该方法通过显色反应，利用肉眼观察进行半定量分析，但通常会因为检测者的视觉感官不同而产生误差。该方法的局限性在于易受光线的影响，灵敏度和选择性不及电化学法。荧光法的选择性好、检出限低，但是在检测器件的便携性上还有很大的发展空间。化学发光法、电化学法以及电化学发光法在检测灵敏性、选择性上有一定的优势，但是限于电极易污染以及背景信燥比高等原因不能得到广泛应用。 因此，近年来，除了对纸基器件的材料性质和器件性能有所研究外，研究者在高通量快速检测多种疾病检测应用中也取得了较好的成果。在荧光纸基器件方法上的发展应用，分别对荧光材料包括有机染料、量子点、金属纳米簇、上转换纳米颗粒、碳点等进行介绍，举例说明其在体外检测中的应用。例如，核酸检测、蛋白检测、细胞检测等，同时也指出了其在应用中的不足。因此，设计新型的稳定型、高量子产率、抗漂白性、低毒、生物相容性好、斯托克位移较大的光学材料，需要更多研究者的参与。 体外诊断( IVD) 主要用于检测血液、尿液、汗水、唾液以及组织的液体，获取临床诊断信息，为疾病的预防、诊断提供科学依据，对医疗保健系统至关重要。目前IVD 市场的发展趋势主要包括: ( 1) 自动化、微型集成化; ( 2) 分子化分析;( 3) 个性化。体外诊断提高了诊断的效率，促进了远程现场快速诊断的发展，降低了传染病扩散的风险。 然而，在发达国家广泛应用的IVD 技术，由于设备昂贵、操作专业，目前无法在发展中国家及偏远地区普及。对此，世界卫生组织倡导对于偏远地区的体外诊断需要做到简便灵敏、选择性高、无污染、快速、价格低廉。纸基检测作为一种低廉快速的检测方法，在一定程度上可满足这些要求。 纸基检测的常用方法包括比色法、电化学法、化学发光法、电化学发光法、光电化学法以及荧光法。荧光检测法因其独特的优势，应用在癌症、传染病以及其他生理疾病的检测方面，引起了越来越多研究者的关注。本文将总结荧光纸基器件在体外检测方面的最新进展及应用，并展望未来的研究方向。 1 纸基器件 纸基器件是以纸代替传统的石英、玻璃、硅、高聚物等材料，通过在纸张的表面加工出具有一定结构的微流体通道的微型分析器件，结合了微流控技术和纸的优点。与传统的微流控芯片相比，纸基器件具有以下优势: ( 1) 纸来源丰富，可进行批量生产; ( 2) 不需要外接泵，纸的主要成分是纤维素，流体在纸上通过毛细作用流动; ( 3) 试样消耗量更低;( 4) 检测背景低，有利于光度法检测; ( 5) 生物兼容性好，可通过化学修饰改变纸的性质; ( 6) 一次性便携式分析，操作简便，甚至不需要专业的操作人员。纸基器件为临床诊断、环境监控以及食品安全分析中所需的便携式检测和现场实时监测提供了一个广阔的平台。此外，对于医护人员和医疗设备紧缺的欠发达地区，纸基器件是实现低成本即时诊断的有效工具。在纸基材质选择方面，目前使用最广泛的是Whatman No.1 滤纸。其表面光滑、流速适中。同时硝酸纤维素膜( NC膜) 对生物分子有较高的非特异吸附，适合固定DNA、酶以及蛋白质等生物分子; 蜡光纸韧性好、降解性低、表面光滑，可在其表面固定纳米粒子; 纸巾的吸水性强，固定凝聚血细胞效果好。纸基器件的制作原理是在纸面上形成亲水和疏水通道从而实现对流体的引导。根据制作通道的方法可分为2D 和3D 制作方法，其中2D 制作法包括以下几类: ( 1) 蜡画;( 2) 聚合物油墨绘画或压印; ( 3) 石蜡压印; ( 4) 石蜡浸渍;( 5) 光刻法; ( 6) 石蜡丝网打印; ( 7) 石蜡打印; ( 8) 喷墨侵蚀;( 9) 喷墨打印; ( 10) 柔印; ( 11) 工艺刀切割; ( 12) 激光切割。传统的2D 纸芯片无法实现同时检测多种物质，而3D 纸基器件的出现突破了2D 纸基器件的局限，扩展了纸基器件的应用。3D 纸基器件具有多层结构，其常用的制作方法有两种:利用双面胶将平面图案多层叠加固定或手工折叠。 纸基器件常用的检测方法中比色法是最直观、最常用的一种方法。该方法通过显色反应，利用肉眼观察进行半定量分析，但通常会因为检测者的视觉感官不同而产生误差。该方法的局限在于易受光线的影响，灵敏度和选择性不及电化学方法。荧光法的选择性好、检出限低。化学发光法是根据化学反应在某个时刻发射的光强度来确定反应中某一组分浓度的方法。电化学发光法是将化学发光法与电化学技术相结合的一种新型技术，利用电化学反应进行发光，光学背景信号低、反应可控性强，通过控制电极电位可调节检测的选择性，具有良好的应用前景。电化学方法的灵敏度高、选择性好，检测区不受光线的影响，耗样量少、成本低、易于集成，但是电极易污染。 2 荧光材料 近几年，体外诊断领域出现很多用纸基荧光装置检测可引起人类疾病的细菌、蛋白质、生物标记物、重金属等的实例。纸基荧光装置具有以下优点: (1) 灵敏度高，可达十亿分之一; (2) 荧光探针能提供样品所需的各种特定波长范围，斯托克斯位移和光谱带宽，使荧光检测具有高选择性;(3) 荧光检测可以根据荧光强度进行定性/定量分析; (4) 荧光检测具有较宽的动态线性范围; (5) 检测操作简单; (6) 具有良好的再现性; (7) 所需样品和试剂少; (8) 仅需简单的检测设备。荧光是一种冷发光形式。斯托克斯的位移容易引起对称的激发和发射光谱间的分离(图1a)。图1b展示了在单光子吸收情况下荧光的产生过程。在室温条件下，分子一般处于稳定的基态单重态( S0) ，吸收一个光子后，分子由S0转而处于激发态，吸收过程约10－15 s。分子处于激发态时，当分子的电子自旋与基态相同，仍是单重态，即分子处于第一/第二激发单重态( S1 /S2) 。每个电子能级都有多个振动能级，并符合能量守恒原理。当S2较低的振动能级与S1较高振动能级的能量近似或重叠时，分子将可能通过无辐射方式，由S2过渡到S1的振动能级，实现内部能量转换( 过程约10－12 s)。由于大多数生物分子不显荧光，所以用荧光法测量这些非荧光化合物就需要先将它们接上荧光探针。纸基检测装置中常用的荧光探针有荧光染料、量子点、金属纳米簇、上转换纳米颗粒和碳点等。这几种探针的优缺点列于表1。 2.1 荧光染料 荧光染料是被广泛用于纸基设备中的荧光指示剂，大多是含有苯环或杂环的共轭双键化合物。总的来说，小分子荧光染料具有体积小、荧光强度高、生物相容性好、易于修饰等特点。然而，其存在量子产率低、抗光致漂白能力差、激发光谱窄和发射带宽等缺点，故选择适当的荧光染料变得相当困难。荧光染料具有可剪裁性和光谱可调性的优点，可用作纸基检测指示剂辨别检测物。 2.2 量子点 量子点( QDs) 是直径范围为2 ～ 10 nm 的零维无机半导体纳米晶体，具有高度荧光性能。量子点由成千上万个Ⅱ—Ⅵ族( 例如CdSe 和CdTe) 、Ⅲ—Ⅴ族( 例如InP 和InAs) 或Ⅳ—Ⅵ族( 例如PbSe) 的原子组成。表面裸露的量子点通常表现出低荧光量子产率，主要是因为其表面存在缺陷。为解决这一问题，研究者提出了量子点的核壳配置结构和分子涂层策略，并将其分为三种类型: 1 型量子点的外壳材料带隙高、内核材料的带隙低，这种结构倾向于将载流子集中到内核; 2 型量子点则正好相反; 3 型量子点内核材料的导带( CB) 或价带( VB) 介于壳体材料的带隙之间。与荧光染料不同是，量子点的电子从VB 激发到CB 时，会在VB 中产生一个空穴，并在吸收光子后形成电子-空穴对，电子-空穴对的重组将会产生荧光。量子点具有宽激发光谱、窄而对称的发射光谱，长荧光寿命和明显的斯托克斯位移。通过改变量子点的尺寸、形状和组成可以获得各种不同的颜色。这些特征使量子点成为纸基诊断检测离子、核酸、蛋白质、细胞等的绝佳选择。 2.3 金属纳米簇 荧光金属纳米簇由几个到几十个原子组成，这些原子具有与电子费米波长相当的尺寸和离散能级。由于其良好的生物相容性和优异的荧光性质而引起研究人员的极大兴趣。通过改变尺寸，原子堆叠模式和外露晶格面可以调节金属纳米簇的结构和性质。金属纳米簇的发光是通过d 轨道占有电子的能级最高轨道( HOMO) 和sp 轨道未占有电子的能级最低轨道( LUMO) 之间的电子跃迁实现。金属纳米簇因具有优异的光稳定性和水溶性、不膨胀性、尺寸决定颜色、鲜明的对比度等特点，其对生物传感和成像非常有用。然而，迄今为止，对金属纳米簇在纸基荧光检测上的研究探索报道较少。 2.4 上转换纳米颗粒 上转换纳米颗粒( UCNPs) 能产生反斯托克发光，能通过上转换机制将近红外光( 800～1 000 nm) 转换成紫外/可见光( 较短波长) 。UCNPs 的反斯托克过程是通过连续吸收多个低能光子，实现高于低能光子能量的光子激发。由于UCNPs的发光原理和传统发光过程不同，它能效抑制自发荧光和散射光的干扰，从而保证较高的信噪比。UCNPs 通常由无机基体材料和掺杂其中的三价镧系元素组成，例如Er( Ⅲ) 、Yb( Ⅲ)、Ho( Ⅲ) 、Nd( Ⅲ)和Tm( Ⅲ) 。三价镧系元素具有吸收多个低能量光子的能力，且三价镧系元素因对电子具有屏蔽效应从而可实现亚稳态能级特性。UCNPs 的量子产率受可调节的纳米颗粒尺寸( 10 ～ 100 nm) 的影响。由于激发光取决于数千个聚集的镧系元素离子的组成和结构，而不是它们的尺寸或形状，因此UCNPs 具有高耐光性。此外，UCNPs 通常通过共沉淀、热分解和溶剂热法合成，适合用作生物标记物。例如，Xu 等已经开发了一种使用UCNPs 对癌胚抗原进行高灵敏度的纸基荧光检测装置。 2.5 碳点 碳点( C-dots) 被定义为直径在2 ～ 8 nm 的碳原子簇，通常成分中还包含大量的氧、氢、氮。碳点相比其他荧光材料具有高水溶性、高耐腐蚀性、易功能化、高抗漂白性、低毒和良好的生物相容性等优点。此外，简单的一步法就可以合成强荧光且无掺杂或标记的碳点。然而，碳点仍存在限制其在荧光检测中使用的缺点。例如，碳点不能发出强烈的长波长荧光。碳点的荧光是如何形成的仍然存在有争议。普遍认为碳点在近紫外区域有弱吸收，但在可见光区域有强烈的多元发射，这是因为表面缺陷有助于sp2 区域的π 和π* 电子能级中的电子-空穴对进行复合。因此，通过修饰表面进行钝化和掺杂形成更为稳定的表面缺陷，有助于提高碳点的量子产率。例如，Kurdekar 等设计了基于碳点的纸基高效免疫测定装置，用于对HIV-1 p24 抗原的早期诊断，该装置证明了碳点是诊断测试中极好的荧光指示剂。Wang 等也选择用碳点作荧光指示剂来检测DNA，碳点可以放大有效信号，增强检测灵敏度。 3 荧光纸基器件的应用 在健康医疗体系外诊断中，纸基器件的体外检测作为早期诊断，对于成功治疗与预防疾病起着至关重要的作用。到目前为止，荧光纸基器件已成功用于尿液、唾液以及血液中多种分析物的检测，如核酸、DNA、蛋白质、细胞以及葡萄糖和乳酸等代谢产物的分析检测( 表2) 。 3.1 核酸检测 核酸检测作为基因检测、药物开发以及食品安全病原体测试至关重要的检测手段，通常需要昂贵的仪器支撑和专业技术人员操作，因此，开发简单易用且廉价的检测器件具有重大意义。荧光纸基器件检测作为核酸物质快检的方式，受到越来越多研究者的青睐。Dou 等设计的3D 纸基器件，具备环介导等温扩增法的优点，能快速灵敏地检测脑膜炎双球菌。该器件以聚二甲基硅氧烷( PDMS) 、玻璃以及滤纸为材料，以玻璃作为基片，PDMS 层分别作为盖片和微腔，标记钙黄绿色和花青素的滤纸作为检测层并置于器件中间。这种3D 器件不仅可以用于现场定性诊断分析，还可以用于实验室检验的定量分析。它能在45 min 内检测三个复制结果，接近单细菌检测灵敏度。这种低成本的快速检测器为偏远且缺乏仪器设备的地区提供了非常有效的诊断方式。Scida 等报道了通过使用3D 纸基器件实现单链DNA 杂交诱导荧光检测法(图2)，利用荧光标记的单链DNA 竞争未标记的单链DNA，通过荧光强度来定量检测物的DNA 数量。该方法的检测限低于5 nmol /L，相对标准偏差低至3%。此外，镧系上转换材料也可用于纸基器件，标记DNA 并检测其含量，检测限低于3.6 fmol。 3.2 蛋白的检测 体内蛋白的异常表达会导致相关疾病，快速、定量检测这些疾病的蛋白标志物在临床诊断中意义重大。例如，Thom 等基于纸基荧光法检测β 半乳糖肝酶，将荧光图片数字化定量分析其含量，可在30 min 内定量检测浓度低至700pmol /L 的β 半乳糖肝酶。Wang 等将红色量子点和绿色量子点锚定在纸基表面，利用比率荧光探针检测出半胱氨酸和高半胱氨酸浓度。红色量子点嵌入二氧化硅表面作为参比信号，绿色量子点附着在二氧化硅表面作为反应信号，当加入邻二氮菲物质时，绿色荧光淬灭，而红色荧光保持不变，随着检测物半胱氨酸/高半胱氨酸的加入，绿色荧光逐渐恢复。因此，依据两种颜色的比率可以定量分析半胱氨酸/高半胱氨酸的含量，检测限低至2.5 μmol /L( 半胱氨酸) 和1.7μmol /L( 高半胱氨酸) ( 图3) ，且颜色变化肉眼可分辨。Yan等同样提出利用比率荧光探针来检测络氨酸酶的活性。Petryayeva等利用荧光探针的荧光共振能量转移法检测蛋白水解酶，在5～60 min 的检测时间内可实现低至1 ～ 2 nmol /L 的检测限。 3.3 细胞检测 纸基器件还可以用来定量转移肿瘤细胞或间接检测生物标记的细胞。定量检测的循环肿瘤细胞被认为是癌症诊断的有效方法之一。Truong 等提出了一种基于聚合酶链式反应( PCＲ) 方法定量检测纸基器件上多种培养细胞的方法。该方法选用MCF-7 和MDA-MB-231 细胞作为样本，通过比较荧光成像和定量PCR反复准确定量量化纸基上的细胞数量，以区分其他类别细胞，该方法最低可检测到50个细胞。Liang 等研发了石墨烯纳米传感器结合量子点荧光探针同时检测多种肿瘤细胞的方法，该方法在检测过程中可肉眼观察到颜色变化，并定量分析出细胞数量。MCF-7、HL-60和K562 细胞最低分别可检测到62 个、70 个和65 个细胞。Liang 的这项设计为癌细胞检测提供了新的传感平台，低成本、高效率地实时监控多种癌细胞(图4)。Wu 等也设计出一款结合电化学和荧光法的纸基器件，超敏检测癌细胞。此方法以人类肝癌细胞株Huh7 作为模型，使用量子点荧光探针有效提高检测灵敏度，并放大信号。利用荧光纸基器件检测癌细胞，为体外检测提供了一个简单而廉价的即时检测平台，在临床诊断中具备较大的应用前景。 3.4 代谢产物检测 在人体代谢中，代谢产物起着非常重要的作用。代谢异常往往是疾病的前兆，因此检测代谢产物异常是疾病早期诊断的重要手段，而价格低廉的纸基器件在很大程度上能满足这一需求。例如，Velu 等研发了一种利用荧光量子点来快速检测赭曲霉毒A( OTA)的纸基器件，检测限为10 nmol /L，可用手持紫外灯和相机来获取结果，操作便捷。有机磷由于其具有高毒性，在体内会引起严重的人类健康问题，因此快速检测有机磷的意义重大。Zhang 等开发了一种利用锰鳌合硫化锌的纳米探针与比率型荧光反应测定有机磷的方法。当有机磷存在时，红色荧光会增强，绿色荧光不变; 随着有机磷的增加，比率荧光的比值会增大，荧光信号由黑绿色变成紫色，最后变成红色。通过荧光比率的变化定量分析有机磷的含量。其检测限低至1.8 μmol /L。 3.5 其他应用 荧光纸基器件除了在体外检测诊断中得到了大量应用外，在食品质量控制以及环境监测中也有应用。科研工作者致力于开发更快、更高效的荧光纸基检测器检测食物或水中的除草剂、病原体、农药、金属以及其他有毒物质。各种新型纸基器件的开发将成为疾病预防性检测的重要方法。 综上所述，纸基器件因具有检测快速、选择性高、灵敏性高、成本相对较低和无污染的优点，受到体外检测以及其他相关应用检测的青睐。荧光染料具有分子小、易于修饰、良好的生物相容性等优点，但是其荧光量子产率低且容易发生光散射和光漂白现象，在应用中在受到一定的限制。量子点具有荧光量子产率高、单色性好、光稳定性好等优势，然而其生物相容性差、毒性大，限制了其在生物方面的应用。金属纳米簇具有可调节荧光发射波长、分子小、无毒以及较好的生物相容性等优点，但由于较难获得单分散金属簇，不利于广泛应用。上转换纳米粒子具有稳定性好、荧光量子产率高、光散射小、生物相容性较好以及斯托克位移较大等特点，但近红外光作为激发光源的苛刻条件极大地限制了它的应用。碳点具有优异的光学性质、良好的水溶性、低毒性、良好的生物相容性等优点，但碳点不能在长波段发射荧光且荧光发射机理饱受争议，导致其使用受限。因此，设计出新型、稳定且具有量子产率高、抗漂白以及毒性低、生物相容性好、斯托克位移较大的光学材料迫在眉睫。荧光纸基器件检测仍存在很多问题亟待突破。例如如何提高荧光纸基器件的实用性、重复性以及检测设备的便携性等。随着纸基器件的制备方法、处理方法的不断更新，制备便捷式、实用化的纸基器件成为可能，从而可实现快速灵敏检测高致病风险疾病(肿瘤、心脑血管疾病、传染病等) 。同时它还可广泛应用于可穿戴微创设备，实现对血液或者汗液中疾病标志物的动态实时检测。通过不断优化，荧光纸基器件将不局限于欠发达地区的医疗诊断，还可以为发达地区的现场急救、临床试验、医疗保健提供低成本的诊断途径。纸基器件在临床诊断、食品安全分析以及环境监控等领域都将发挥重要作用。 免责声明：以上内容所载的文/图等稿件部分转载/复制于网络。版权均归原作者所有，不代表个人观点。保留转载文章的出处及原刊载媒体上的署名形式和版权声明（如有），但本人对转载文章的版权归属和权利瑕疵情况不承担核实责任。如任何单位或个人认为转载的文章涉嫌侵犯其合法权益，请及时提出书面意见并提供相关证明材料和理由，会在收到上述文件后将采取相应删除措施。
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