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TP53基因被称为“基因组卫士”（Guardian of the genome），但TP53基因却是人类各种癌症中最常出现突变的抑癌基因。 TP53基因位于17号染色体p13，全长16-20kb,含有11个外显子，转录2.8kb的mRNA，编码一种分子量为43.7KDa的p53蛋白质（一种核内磷酸化蛋白）。因蛋白条带出现在Marker所示53KDa处，命名为p53蛋白。 作为一个重要的抑癌基因，其野生型使癌细胞凋亡、帮助细胞基因修复缺陷，从而防止癌变。TP53基因的突变或失活对肿瘤形成起重要作用。大约一半肿瘤至少携带一个TP53基因变异，如此广泛存在于各种肿瘤，让研究者们对该靶点非常着迷。 随着NGS技术的进步，基于微创或无创液体样本的测序让癌症早筛成为可能。近日，在一项发表于Cell Reports题为“Ultra-Sensitive TP53 Sequencing for Cancer Detection Reveals Progressive Clonal Selection in Normal Tissue over a Century of Human Lifespan”的研究中，来自美国、奥地利、比利时、瑞典和法国的科学家们通过超高精度Duplex SequencingTM技术（源自TwinStrand Biosciences公司）在尿液样本中检测TP53基因突变以实现卵巢癌的早筛，灵敏度达80%。 不过科学家们除了在肿瘤DNA中检测到了TP53基因突变，在几乎所有女性（无论是否患癌）尿液样本中都检测到了低频的TP53突变，而这些突变会随着年龄的增长而增加。研究表明亚克隆肿瘤进化进程是正常人体衰老普遍存在的现象，因此作者建议在进行高灵敏度临床肿瘤诊断时，要注意区分肿瘤驱动突变与衰老相关突变。 该项研究主要目的是为卵巢癌的早筛开发一种高灵敏度的早筛方法。全球每年新确诊卵巢癌患者超过25万，其中2/3的患者会死于卵巢癌。如此高的死亡率究其原因是很多卵巢癌在诊断前就发生了转移，同时也缺乏一种有效的筛查和早期诊断方法。 超过60%的卵巢癌患者被诊断时已经到达了晚期，而这个阶段的5年生存率只有29%。相比之下，没有发生转移的卵巢癌患者生存率是92%。这就意味着如果能在卵巢癌早期诊断出来，将会大大降低死亡率。 目前最常用的卵巢癌筛查方式是一种结合血清CA-125蛋白水平检测和阴道超声的方法，不过这种方法展示出的生存效益并不高，同时也会因为假阳性而带来伤害，比如给未患癌女性实施不必要的手术。因此，美国预防医学特别委员会并不推荐这种筛查方法，亟需更好的方法来对卵巢癌进行早筛以满足临床需求。 近年来，液体活检已经被证实能够对肿瘤进行无创性的检测，因肿瘤细胞或DNA会释放到血液或身体其他液体中。早在2013年，Kinde等人就通过检测提取自常规巴氏涂片的DNA检测肿瘤驱动基因突变证实了液体活检能够应用于卵巢癌筛查。尽管当时的灵敏度只有41%，但却让人们看到了通过对脱落到女性生殖道的肿瘤细胞进行基因检测以实现卵巢癌检测的希望。随后另一项结合了巴氏涂片和血浆样品的研究将灵敏度提高至63%。另外，通过子宫拭子取样也能够提高灵敏度。 本文研究团队开发了另一种收集肿瘤细胞的方法---子宫腔灌洗（如下图所示）。该方法通过用清水冲刷子宫壁和输卵管提高细胞收集效率，而输卵管是大部分严重输卵管癌的原发灶。通过该取样方法，我们将卵巢癌的检测灵敏度提升至80%。 不过最大的挑战并不是来源于取样方法，而是卵巢癌早期的驱动基因突变只占了灌洗液总DNA的很小一部分。为了要检测如此微量的DNA，ddPCR其实是比较好的方法，但是ddPCR只能检测已知突变，所以也不适合。 二代测序（NGS）被广泛应用于基因突变检测，但是其背景错误率高达1%左右，对于检测低频基因突变差强人意。在作者之前研究中构成80%灵敏度的突变中，传统的NGS方法会漏掉25%。 目前，最精准的NGS方法是Duplex Sequencing（DS），该方法采用双链分子标记以修复测序错误并能将错误率从10-3降低到10-7。2016年，该研究团队已经证实采用DS的方法在提取自腹膜腔的DNA中检测卵巢癌驱动基因突变，灵敏度可以做到1/25000。如此高的灵敏度导致的结果是在健康女性的腹膜腔液和外周血中都检测到普遍存在但非常低频（＜0.01%）的TP53突变。这种生物背景突变看起来像是肿瘤TP53突变，但更像是从正常衰老过程产生的突变。这种情况在近年的一些研究论文中也有提及。 在本研究中，作者结合了已报道最灵敏的卵巢癌检测取样方法---子宫灌洗液（UL）以及目前所知最高精确度的测序方法---DS。高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是最常见并且死亡率最高的组织分型，引起70%-80%的卵巢癌死亡。超过98%的HGSOC携带TP53突变，所以TP53是一个理想而具有成本效益的测序靶点。此外，在HGSOC形成过程中，TP53是第一个发生突变的基因。 本研究的主要目的是证实采用DS深度测序UL来源的TP53以实现卵巢癌检测的可行性。作者利用DS的高精确度来识别真阳性的肿瘤驱动突变并独特检测可能会影响诊断结果的低频衰老相关突变。 为了更好地理解这些生物背景突变，研究者对全年龄阶段未患癌女性组织样本进行了详细的体系TP53突变特征描述。 结果发现： 1. DS方法能够在UL样本中以高灵敏度检测卵巢癌突变； 2. TP53突变随年龄增长而增加； 3. UL样本中的TP53突变并非是随机的，而是正向选择的； 4. UL样本中的TP53突变与人类肿瘤发现的TP53突变非常相似； 5. 在中年女性的健康组织样本中，TP53突变也很常见； 6. 随着年龄的增长，TP53突变在数量和肿瘤特性上也会增加； 7. TP53在新生儿中是随机的，但随着年龄增加变为正向选择；
8. 在cfDNA和腹腔灌洗液中的TP53突变与实体组织的模式一致。 如果低频TP53突变是普遍存在的，那么要与驱动肿瘤发生的TP53突变区分开，设置合适的阈值以排除背景干扰，或许是一种好办法。 |
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