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样品制备是生物电子显微镜(EM)最重要的方面，因为它影响从样品本身的保存到可以获得的信息种类的一切。在开始电子显微镜项目之前，确定对样品提出的问题是至关重要的。可以进行一个假设驱动的研究，不仅可以节省很多钱，还可以让更快地获得有意义的结果。简而言之，应该为你的样本类型和你要问的问题优化样本准备。 任何生物EM样品制备的第一步都是固定。固定是一种方法，通过后续的处理和成像阶段，使生物标本的所有代谢过程停止并尽可能地保持在接近生命状态。固定方式主要有两种:化学固定和冷冻固定。 化学固定 化学固定是生物EM最常用和最简便的固定方法，化学物质一旦应用于生物样品，就会在氨基酸、蛋白质和脂类之间形成交联，通常是以共价键的形式。化学固定比通常用于光学显微镜的凝固性固定剂(如溶剂和乙酸)更能保存形态学。然而，化学固定也会导致蛋白质变性，这在下游抗体标记技术中可能存在问题。当使用相关的光学和电子显微镜(CLEM)，这将是一个挑战。 有几种化学物质被广泛用于初次固定，包括戊二醛、甲醛和丙烯醛。戊二醛和丙烯醛引起蛋白质广泛、快速和永久的交联。可能应用戊二醛作为唯一的固定剂，然而，它渗透到样品中很慢，在此期间可能发生组织降解。因此，许多研究人员选择戊二醛与甲醛结合，甲醛能迅速穿透样品，提供了一种暂时的蛋白质交联，随后戊二醛取代了这种交联。
固定剂必须应用于缓冲溶液中的样品，缓冲溶液是固定剂的等渗载体，可防止细胞收缩或膨胀，从而使样品尽可能接近于活的状态。缓冲溶液的渗透压可以根据样品进行调整。 通常采用二次固定步骤，尤其是TEM样品制备。四氧化锇是最常见的二次固定剂，它具有保存脂质膜的优点，而不只是醛固定。它还充当着色剂，为样品提供了大量的对比度和导电性。 冷冻固定 冷冻固定要求样品足够快地冷冻以将水从其正常液态冷却至其固态，而没有中间冰晶相。冰的体积大于液体形式的水，这会导致生物超微结构的扭曲。在冰晶形成期间，仅纯水冻结，导致细胞内溶质的分离和特征性的分离假象。有几种方法可以实现水的透明化，如骤降冻结或高压冻结。虽然大量的样品都适合冷冻，但只有少量样品会产生无定形（不含冰晶）冰，通常距离样品边缘不到100微米。这意味着虽然病毒，蛋白质，细胞器和细胞可以透明化， 但由于体积大，很难实现组织和多细胞生物的良好冷冻固定。
冷冻电子显微镜（cryo-EM）包括对冷冻和水合的生物样品进行成像，而不需要污渍或固定剂。 Cryo-EM通常是指透射电子显微镜（TEM），但冷冻阶段（冷却到可以发生冰晶的温度的显微镜阶段，通常使用液氮）也可用于扫描电子显微镜（SEM）。虽然冷冻固定很快（毫秒）并且可以最好地保存样品，但是冷冻EM具有挑战性，需要专业设备来准备，储存，保存和成像生物样品。此外，冷冻样品易受电子束损坏。在低温EM中，低剂量成像方案限制了撞击样品的电子数量，从而减少了损伤。然而，这些可能具有最终图像中的低信噪比的缺点。通常需要数据处理来改善对比度。 即使没有冷冻阶段或在显微镜上执行cryo-EM的功能，也可以使用冷冻固定来修复样品。与化学固定后使用相同的样品处理步骤可以应用于冷冻替代后的冷冻样品。 固定后样本制备 固定后，样品脱水是必要的。这通过在水中使用梯度系列的乙醇，甲醇或丙酮溶液来实现，通常为30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，并且在100％下有若干变化。可以在-90℃对低温固定样品进行脱水，在非常高的溶剂浓度（95％或更高）下，其中一些可能包括污渍，如四氧化锇，用于对比。 常规SEM的样品通常通过临界点进行干燥，安装在样品短柱上，并涂覆几纳米的导电涂层（金，铂/钯或碳）。 对于TEM和高级SEM技术，样品嵌入树脂中，树脂是一种粘性液体，可在几小时或几天内渗透样品，并使用热或紫外光聚合。树脂在切片期间为样品提供支撑（切片厚度为40-500nm）。样品在进入显微镜之前或在显微镜内进行切片。 健康和安全因素 用于生物电子显微镜的所有化学品和固定程序都是危险的，有些是极毒的。它们专为杀死和保存细胞而设计，操作过程应使用适当的健康和安全设备，如手套，护目镜和通风橱进行化学处理。 所有化学品都将提供安全数据表（SDS），并且必须在使用化学品之前进行风险和/或COSHH评估。 选择的固定方法对于获得可靠的结果是必不可少的。在开始下一次EM实验之前，请务必花时间优化样品制备方案。 |
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