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【来源/作者】北纳创联 【更新日期】2015-08-24 动物疫病检测领域的标准质控品属生物标准物质，多以生物基质材料为基础而研制，主要用于生物样品含量、活性、效价测定或其特性鉴别．对病原定量检测系统的标准化、检验结果的准确性和可比性具有重要的参考价值。目前，全世界最主要的国际标准物质和参考物质生产者英同同家生物标准与检定所NIBSC(natlonal institute for biologlcal standards and contr01，NIBSC)目录中列有600余种生物制品标准物质．大部分为血清、疫苗、抗体等，极少量为病毒核酸标准物质，微生物核酸标准品仅有结核杆菌核酸标准物质1种。我国国家标准物质网上公布的也多为血清、疫苗、蛋白质、抗体等国家标准物质．在核酸标准物质研制方面均刚处于起步阶段。2005年卫生部临床检验中心研制的乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)血清、丙肝病毒核糖核酸(HCV RNA)血清被国家质检总局批准为国家二级标准物质，其量值可溯源到第一代HBV DNA和HCV RNA国家一级标准物质。这是我国在核酸检测领域首次引入国际标准。 随着分子生物学技术的发展．以荧光聚合酶链式反应为基础的核酸扩增技术成为动物疫病定量检测的主要手段．但核酸扩增检测是比较复杂的生物学测定．包括核酸提取、扩增和扩增产物的检测以及多个酶的反应。另外样本中核酸的不均一性和样本基质的多样化也给标准化带来一定困难。因此制备核酸标准质控品需要最大限度考虑上述影响．并且需要核酸标准质控品具有足够均一性、稳定性且无生物传染性．目前病原核酸标准质控物主要有裸露的DNA或RNA片段，病毒颗粒．以及盔甲RNA(Armored RNA)等； 一、裸露核酸 裸露核酸如DNA或体外转录RNA即没有任何蛋白包裹的核酸片段。通常将特定病毒拟扩增的核酸片段。PCR克隆构建至特定质粒载体中．核酸为RNA的病毒还需反转录为cDNA．再经体外转录方式进行构建后．得到1种与相应cDNA互补的RNA(cRNA)。cRNA的构建方法基本上是首先将所需的RNA逆转录为cDNA，再经PCR扩增后，产物DNA片段经T克隆克隆人相应的质粒载体，然后再构建人含T7启动子的载体，体外逆转录得到相应的cRNA。这种裸露的RNA即可作为相应RNA RT-PCR测定的质控品和定量标准品。 裸露核酸片段的构建方法简单，可在吸光度260 nm波长下比色进行准确定量，且易于定值．但缺点是：a)稳定性差．难于保存。cRNA片段完全暴露于外界环境中，很容易被环境中的核糖核酸酶(Rnase)所降解。b)cRNA由相应模板DNA逆转录产生，原有模板DNA的污染很难通过加Dnase消化去除。c)不能监测样本中RNA病毒颗粒的裂解效率。cRNA直接暴露于样本溶液中，无法模拟和监测真正病毒颗粒的核酸提取过程。由于上述原因．cRNA质控品和标准品很难在临床RNA病毒RT—PCR检测中实际应用．目前仅限于一些文献报道。然而随着真空冷冻干燥技术的发展，裸露核酸片段的稳定性也有望得到大幅提升，一些支持合成核酸作为标准物质原料的专家认为．标准物质在于提供一个准确的数值．而不是关注提取效率，因此不需要考虑提取过程。但冻干标准物质在使用时需要复溶，虽然稳定性得到了提高，但复溶的不确定度比较大，影响了核酸标准物质的量值传递。从现有技术上说，还很难从绝对意义上对核酸的量值进行确定。 二、病毒颗粒 病毒颗粒最早被利用作为质控物，主要包括病毒、灭活病毒或疫苗或阳性患者血浆、血清，此类生物活性物质作为质控物时，必须在生物安全环境下操作和做好安全防护措施：即使是现在使用阳性病毒作为质控物也较为常见，世界卫生组织(world health organization，WHO)曾应用含丙型肝炎病毒(HCV)颗粒的血清作为质控物，组织实验室问HCV核酸扩增校准。也有研究者用灭活疫苗作为阳性参照物，如用口蹄疫疫苗作为阳性标准建立检测口蹄疫核酸的RT—PCR和RT—LAMt，方法。此外，也可应用对检测无干扰的同属病毒作为内部质控物．如戊型肝炎病毒(HEV)和戊型肝炎病毒同属杯状病毒属。都是单股正链RNA病毒，两者也具有较相似的理化性质．但感染的宿主不同，如有人研究戊型肝炎病毒的RT—PCR检测方法时，应用猫杯状病毒作为内部质控物，取得很好的结果。因而此类生物质可作为的质控物来监控病毒颗粒裂解效率和核酸提取等整个检测过程。但是应用该类病毒作为内标质控物用于RT—PCR检测时．由于需要有多对引物，可能会引起引物模板间的相互干扰，并且多个引物也会增加非特异性扩增的机会，所以病毒不是RNA检测的理想质控物。总之，用病毒颗粒作为质控物或标准物，虽然可监控病毒颗粒裂解效率和核酸提取，弥补了裸露核酸片段作为质控物和标准物的不足，但由于病毒颗粒有传染性、其制备运输困难，在社会上会引起伦理问题，因而限制了其作为质控物或标准物的发展与应用。 三、内含特定核酸片段的病毒样颗粒 已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒(tobacco mosaic uirus，TMV)的外壳可以耐受Rnase的作用，因此．如将特定的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，就可以使其免受环境中Rnase的降解。同时，在应用过程中还可以模拟病毒颗粒监测核酸提取过程中的病毒裂解效率。 (一)包裹于MS2噬茵体包膜蛋白内的RNA MS2噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3569bp．有编码成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白等4种蛋白质分子。噬菌体由1 80包膜蛋白单体、一分子成熟酶蛋白和一分子基因组RNA组成。在较早期的大肠杆菌病毒——MS2噬菌体包膜蛋白的研究中，发现包膜蛋白与操纵子RNA序列有特异性相互作用，这种作用可在引发噬菌体外壳组装的同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内，因此如果将特定病毒RNA的cDNA克隆于MS2噬菌体包膜蛋白基因序列cDNA下游，并在其下游插入终止子，转录后得到带有噬菌体操纵子RNA序列的特定病毒RNA转录本，随后操纵子RNA序列就可以引发噬菌体包膜蛋白组装成外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部分噬菌体基因组包装到包膜内，构成噬菌体病毒样颗粒。 在构建质粒表达载体时，需将噬菌体成熟酶蛋白、包膜蛋白基因序列cDNA克隆表达于表达载体启动子下游，经诱导表达后，所表达的包膜蛋白不仅可作为病毒样颗粒的结构成分，还可作为基因表达调节因子和pac信号对表达过程进行调节．使包膜蛋白的表达和RNA转录协调一致。组装所得噬菌体样颗粒有成熟特性，从而具有Rnase抗性。 研究发现，将编码MS2噬菌体相应蛋白的cDNA序列连接到表达载体，如pET28bT7启动子下游经过诱导表达得到成熟酶蛋白和包膜蛋白，在成熟酶以及噬菌体基冈组RNA片段的协同作用下，组装得到耐Rnase的病毒样颗粒。据此．我们成功构建了表达载体p1NCCL，该表达载体经原核表达后，得到的病毒样颗粒具有耐Rnase的特性。李金明等将HCV RNA、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS：噬菌体1 9000基因组下游，经转化细菌表达后．即可得到具有耐Rnase特定的内含特定RNA的病毒样颗粒。目前，我们还完成了构建肿瘤标志物．如前列腺特异抗原(pmstate spcclflc antlgen．PSA)和甲胎蛋白(a—fetoprotem，AFP)的mRNA病毒样颗粒的表达载体。由于p1NCCl。表达载体的通用性，可以预见其在涉及RNA的标准品和质控品的研制中将具有极为广阔的应用前景。 (二)包裹于烟草花叶病毒(TMV)包膜蛋白内的RNA 将特定的病毒RNA序列的cDNA与烟草花叶病毒(TMV)的包膜基因序列cDNA一起克隆连接到表达载体，也可诱导表达包膜蛋白并组装成病毒样颗粒。在诱导表达过程中．外源基因表达产物可随同组装的TMV颗粒一起组装到病毒颗粒内。但在该过程中．既要注意病毒基因组的组成，又要注意引入外源基因序列的位点，这样可以确保病毒基因组引发包膜蛋白的组装．并使组装的颗粒具有成熟特性，即Rnase抗性；同时．应确保引入的外源基因序列不会在重组过程中发生丢失现象。 使用内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA作为RNA病毒RT—PCR检测的质控品和标准品，具有下述优点： a)无生物传染危险性； b)作为RNA RT PCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性； c)在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的模拟作用。由于表达产物为噬菌体样颗粒具有很好的病毒颗粒模拟功能，因此，在核酸提取过程中与标本中真正病毒核酸提取过程有很好的相似性。 此外，也有人应用牛病毒性腹泻病毒(bovine vlral diarrhea vlrus．BVDV)作为检测HCV的内部标准品，或者用HcV病毒颗粒作为检测HCV RNA的标准品代替世界卫生组织提供的HCV标准品，或者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA标准品，但是这些技术无法克服病毒颗粒传染性、病毒颗粒制备、运输困难等问题，也就是说病毒颗粒不是理想的标准品。 综上所述，在RNA病毒RT—PCR检测中．影响试验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂问题等．这些因素均可能会影响PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，PCR测定必须使用质控品进行严格的室内质量控制才能保证结果的可靠性。此外．进行定量测定，必须有定量的标准品或内标。内标还可起到单管即时质控的作用。一个稳定可靠，且无生物传染危险性的RNA质控品和标准品，对于保证RNA病毒的RT PCR检测质量具有重要意义。在这一点上，裸露的RNA或病毒颗粒及病毒替代品均难以作为理想的质控品和标准品。而采用分子克隆和原核表达方法构建的内含特定病毒RNA片段的噬菌体病毒样颗粒则能较好的解决这些问题，其不但对于RNA病毒RT PCR检测的标准化。而且对于特定的mRNA的检测等均有着潜在的应用价值。 |
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