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【摘要】 目的探讨旷场实验(open field test，OFT)和明暗箱实验(1ight．dark box。LDB)作为昆明小鼠状态焦虑动物模型的相关性。方法20只成年雄性昆明小鼠先后放入旷场敞箱和明暗穿梭箱，摄像系统记录5 min的行为变化。实验间隔l周，实验参数如下：OFT中央区停留时间百分率(OFT-Ctime％)、中央区水平运动百分率(OFT-Ccress％)、总水平运动得分(OFT—Cross)、总垂直运动得分(OFT-Rear)和粪便粒数得分(OFT-FB)，LDB明区停留时间百分率(LDB—Ltime％)、明区水平运动百分率(LDB·Lcress％)、明区垂直运动百分率(LDB—hea扬)、穿梭次数得分(LDB-Transition)、总水平运动得分(LDB-Cross)、总垂直运动得分(LDB-Rear)和粪便粒数得分(LDB—FB)；采用因子分析、聚类分析和相关分析统计方法进行数据处理。结果①因子分析和聚类分析提示，OFT／LDB独立评价时具有相似3维结构：OFI'／LDB焦虑因子、OFT／LDB活性因子和OFT／LDB情绪因子；OFT·LDB合并评价时则为五维结构：LDB焦虑因子、OFT焦虑因子、LDB活性因子、OFT-LDB情绪因子和OFT活性因子。②相关分析提示。OFT情绪因子与LDB情绪因子具有较好相关性(Pearson=0．383，P<0．05)；LDB焦虑因子与LDB焦虑因子(Pearson=0．989，P<0．01)，OFT焦虑因子与OFT焦虑因子(Pearson=0．934，P<0．01)，LDB焦虑因子与LDB焦虑因子(Pearson=0．956。P<0．01)，O刚LDB情绪因子与OFTLDB情绪因子(Pearson=0．835，P<0．01；Pearson=0．696，P<0．01)。OFT活性因子与OFT活性因子(Pearson=O．926，P<0．01)具有较好相关性。结论OFT／LDB独立评价时具有相似三维结构，而OFT-LDB合并评价时则为5维结构：仅OFT／LDB情绪因子可以合并。因此，在以“行为组学”联合评价时，各维度并非一一对应，应注意动物模型异质性问题。 【关键词】旷场实验；明暗箱实验；动物模型；状态焦虑；相关性；昆明小鼠 旷场实验(open field test，OFT)和明暗箱实验(1ight．dark box，LDB)是评价实验动物焦虑情绪与运动功能的经典方法，广泛应用于精神神经药理学的基础研究。前期基础研究发现，OFT和LDB具有相似的三维结构：焦虑因子维度，活性因子维度和情绪因子维度。尽管越来越多的基础研究倾向于联合多种动物模型进行“行为组学”评价，但其评价结果往往又不尽一致，从而消弱了最终评价结果的可信度。本研究综合采用因子分析、聚类分析和相关分析多种统计方法，以初步探讨昆明小鼠状态焦虑动物模型的相关性：OFT与LDB具有相似的三维结构，各维度是否一一对应，所反映的焦虑状态是否同质? 材料与方法 一、材料 1．实验动物：昆明小鼠，雄性，由山东中医药大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(鲁)20050015)。室温(20±2)℃，光照12h(6：00—18：00)和黑暗12h(18：00—6：00)环境，自由进水饮食饲养；预适应环境1周后，选取体质量(25±1)g小鼠20只进入正式实验(所有实验均于19：00—24：00进行)。 2．实验装置：旷场敞箱：尺寸内径(50cm×50cm×40cm)，周壁及底面均为灰色，底面用配套软件在电脑上划分为面积相等的25个方格(10cm×10cm)；其中沿墙壁方格称外周格，其余方格称中央格。明暗穿梭箱：尺寸内径(27cm×27cm×30cm)，明箱、暗箱尺寸一致。该仪器以及配套软件均由上海欣软信息科技有限公司提供。 二、方法 l-OFT：操作者将小鼠小心放入旷场敞箱正中格，用摄像系统记录动物5min的行为变化，其中纳入OFT实验参数有：中央区停留时间百分率(OFTCrime％)、中央区水平运动百分率(OFT-Ccrosa％)、总水平运动得分(OFT．Cross)、总垂直运动得分(OFTRear)和粪便粒数得分(OFT-FB)。 2．LDB：操作者将小鼠放入明暗穿梭箱，用摄像系统记录动物5min的行为变化，其中纳入LDB实验参数有：明区停留时间百分率(LDB—Ltime％)、明区水平运动百分率(LDB．Lcross％)、明区垂直运动百分率(100％，LDB—Lrear％)、穿梭次数得分(LDB—Tran—sition)、总水平运动得分(LDB—Cross)、总垂直运动得分(LDB—Rear)和粪便粒数得分(LDB．FB)。 3．实验操作：实验先进行OFT，间隔1周再进行LDB；实验环境由30w红色白炽灯提供照明；每只动物实验结束后清除粪便，用70％乙醇喷洒箱底并用洁净纱布抹干，以免前一只动物的残留气味造成对本次实验的影响；全部实验结束后由不熟悉实验设计人员进行数据人工提取与录入。 4．统计分析：采用SPSS 13.0 for Windows 软件进行统计分析：因子分析由Analyze-DataReduction-FactorAnalysis过程完成，以Principal components提取公因子，以累计贡献率>85％作为因子纳入标准，采用Varimax正交旋转；聚类分析参数由Analyze-Classify-HierarchicalCluster Analysis过程完成，采用R型变量聚类，选择Between-groupslinkage测量方法和PearsonCorrelation距离类型；相关分析由Analyze-Cotrelate-Bivariate Correlations过程完成，所有数据先进行Kolmogorov-Smimov正态分布检验。以P<0．05为差异有统计学意义。 结 果 一、因子分析评价OFT与LDB相关性 1．KMO和Bartlett球形检验：不管独立(OFT／LDB)还是合并(OFT—LDB)评价，实验参数间相关性尚可，适合进行因子分析(KMO=0．598，X2=43．884，P<0．01：KMO=0．573，x2=102．470．P<0．01；KMO=0．527，x2=173．957，P<0．01)。 2．OFT／LDB独立因子分析：OFT／LDB具有相似的三维结构：OFT／LDB焦虑因子、OFT／LDB活性因子和OFT／LDB情绪因子。见图1。 3．OFT-LDB合并因子分析：OFT-LDB具有五维结构：’LDB焦虑因子、’OFr焦虑因子、’LDB活性因子、’OFT．LDB情绪因子及’OFT活性因子。见图2。 二、聚类分析评价OFT与LDB相关性 1．OFT独立聚类分析：OFT实验参数可分为三类：OFT．Ctime％、OFT．Ccross％第一类，OFT-Cross、OFT—Rear第二类，OFI'-FB第三类。 2．LDB独立聚类分析：LDB实验参数可分三类： LDB-Ltime％、LDB-Lcross％、LDB-Lrear％第一类，LDB—Transition、LDB-Cross、LDB．Rear第二类，LDB-FB第三类。 3．OFT-LDB合并聚类分析：OFT-LDB实验参数可合并为五类：OFT-Ctime％、OFT-Ccross％第一类，LDB．Ltime％、LDB-Lcross％、LDB-Lrear％第二类，OFTrCross、OVI'一Rear第三类，LDB—Transition、LDB-Cross、LDB-Rear第四类，oFr．FB、LDB-FB第五类。 三、OFT与LDB相关性分析 1．正态性分布：Kolmogorov-Smirnov正态分布检验提示，所有实验参数和因子均符合正态分布，故采用Pearson相关分析。 2．OFT／LDB实验参数相关性：OFT-Cross与LDB·Transition，OFT-Rear与LDB·Ltime％、LDB．Lcross、LDBI．,rear％、LDB．Transition，OFT．FB与LDB．FB均具有较好相关性。 3．OFT／LDB独立因子相关性：OFF情绪因子与LDB情绪因子具有较好相关性，说明OFrI'、LDB联合评价时情绪因子合并的合理性，并提示OFT和LDB在联合评价动物模型焦虑状态和运动探索活性时存在异质性问题。 4．OFT／LDB独立因子与OFT—LDB合并因子相关性：LDB焦虑因子与’LDB焦虑因子，OFT焦虑因子与’OFF焦虑因子，LDB活性因子与’LDB活性因子，OFT／LDB情绪因子与’OFTr—LDB情绪因子，OFT活性因子与OFT活性因子均具有较好相关性，进一步说明OFT／LDB独立因子与OFT-LDB合并因子的相关性以及OFT／LDB情绪因子合并的合理性。 讨 论 OFT是由Hall于1934年最先提出用于实验动物行为学评价，其最初主要通过FB这一参数来评价啮齿类情绪反应，后来逐渐扩展Cross(与FB成负相关)、Rear(与Cross成正相关)以及其他实验参数。关于OFT结构效度研究，Denenberg等与Whimbey等曾提出OFT具有二维结构：OFT活性(运动)因子维度(Cross)和情绪因子维度(FB)；Royce也曾提出OFF具有三维结构：运动量维度(运动潜伏期、Cross和穿越中央格)、自律性平衡维度(FB)和领地性标记维度(排尿)。 LDB是由Crawley于1980年最先提出作为动物模型来评价抗焦虑药物的药理效应，其最初主要通过Transition、Cross和Rear这三个参数来评价啮齿类焦虑行为。关于LDB结构效度研究，Costall和Belzung提出Transition参数具有习惯化效应，实际上更倾向于评价探索行为； Shimada提出把Ltime％、Lcross％和Lrear％作为评价抗焦虑药物在LDB动物模型的效应参数，尤其是Lfime％具有浓度依赖性；而LapinIP更甚至提出把“走出暗箱频率”作为评价致焦虑剂在LDB动物模型的唯一稳定参数。 本研究结果提示，OFF—Rear与LDB焦虑因子维度参数成较好负相关，LDB-Transition与OFF活性因子维度参数成较好正相关，OFF与LDB情绪因子维度及其参数FB成较好正相关。尽管OFF和LDB具有相似的三维结构，但是其产生焦虑行为的矛盾冲突并不一致：OFF是利用动物对新奇环境的探究习性与对空旷场地危险性的矛盾冲突，LDB则是利用动物对新奇环境的探究习性与对强光线厌恶感的矛盾冲突；而FB所反映的情绪因子维度则基本一致：共同源于动物自主神经系统活性升高。故在以“行为组学”形式联合评价时则可合并为五维结构，提示OFF与LDB作为动物模型在反映焦虑状态和运动探索活性方面存在异质性，而在反映情绪因子维度方面存在同源性。 综上所述：①OFF／LDB具有相似的三维结构：焦虑因子维度、活性因子维度和情绪因子维度；@oFF与LDB三维结构并非一一对应，联合评价时仅情绪因子维度可以合并；③OFT与LDB作为动物模型在评价焦虑状态和运动探索活性方面存在异质性，而在评价情绪活性方面存在同源性；④“行为组学”综合评价抗焦虑药物药理效应时应注意动物模型异质性问题，同时也期待新的动物模型及评价方法的建立。 |
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