|
“孩儿，你看清楚了没有？” “看清楚了。” “都记得了没有？” “已忘记了一小半。” “也难为你了，再好好想想，现怎样了？” “已忘记了一大半...”  《倚天屠龙记》中，老张教导小张体会剑意而忘记剑招的这个片段，其实是很有深意的，尤其对于生命科学研究工作者而言。从零开始设计一个实验课题时，我们往往会参考很多的资料，阅读很多文献。但是读过文献之后，又可能会感觉帮助并不大，由于研究方向、实验目的、样本类型等等的不同，文献中可参考的内容不多。 如果屡次出现这种情况，说明你关注了太多文献中的实验细节（剑招），而忽视了文章的逻辑架构（剑意）。将所有文章都进行精读是效率很低、毫无必要的做法，我们首先需要了解的不是怎么做实验，而是做什么实验。 回到miRNA领域中，由于超过1/3的基因都会受到miRNA的调控，所以miRNA的功能可以说覆盖了生命体的各个时期、各个过程，每个时期、每个过程都可以进行miRNA功能的研究。但是，尽管研究内容纷繁复杂，miRNA功能研究的核心问题是一样的，就是搞清目的miRNA-靶基因-生物学功能这三者之间的联系。再进一步，如果我们将每一篇文献的内容进行分解，就会发现无论哪个方向的miRNA功能研究，都可以大致分为五个模块。 miRNA功能研究的基本思路 1 寻找研究对象 寻找具有我们感兴趣的性质的miRNA或蛋白作为研究对象（如：在某样本中表达量异常升高或降低）。 2 确认研究对象 确认研究对象确实具有我们关心的性质（如：确认其表达量确实在目的样本中升高或者降低）。 3 寻找靶关系 寻找目的miRNA可能与哪些蛋白存在相互作用，或者目的蛋白可能是哪些miRNA的靶蛋白。 4 确认靶关系 确认在体内这种靶关系确实存在，miRNA会降低靶蛋白的表达量。 5 确认生物功能 证明miRNA-靶蛋白这种相互作用关系会导致什么样的生物学功能  图1. miRNA功能研究基本流程举例。a，寻找研究对象。通过分化前/分化后的干细胞miRNA高通量测序结果，找到维持干细胞多能性的miRNA候选。b，确认研究对象。通过功能分析和qPCR手段，确认miR-199b在干细胞里高表达，并且过表达199b有利于干细胞多能性的维持，确认199a为研究对象。c，寻找靶关系。在199a的预测结果中，LCOR及其他两个基因会在干细胞里表达量降低，与199a表达谱呈负相关。d，确认靶关系。通过双萤光素酶实验和western blot等方法，确认LCOR是miR-199a的靶蛋白。e，确认生物学功能。通过体外细胞实验和动物体内实验，确认199a可以通过LCOR降低干细胞对干扰素刺激的敏感性，维持干细胞的多能性，调控乳腺癌的发生（Celià-Terrassa et al., Nat Cell Biol., 19(6):711-723(2017).） miRNA功能研究的实验设计 需要注意以下几点 ● 课题设计之前，首先需要明确研究的是过程中的哪一点。例如，要进行miRNA对肝癌的功能研究，但“肝癌”是非常大的概念，需要精确的清楚课题是针对肝癌中的哪一个通路、哪一个蛋白上，再进行课题设计。否则，即使通过高通量测序找到了研究对象，依旧无从下手。 ● 寻找研究对象，应广泛阅读文献，并且用多种方法分析高通量数据。不同的分析会带来不同的结果，在不同的结果中寻找具有特征的研究对象。 ● 确认研究对象，应采用多角度、多重复的分析方法。确认miRNA表达量或蛋白表达量的方法有很多，使用多种方法共同鉴定可以提高结果的准确度。研究对象的确认是后续实验的基础，必须重视。 ● 寻找靶关系，应熟练使用在线的预测平台，或生物信息学的技术。此外，“miRNA与靶蛋白表达量相反”这一规律也有助于在生物信息学预测之外找到可能存在的靶关系。 ● 确认靶关系，与确认研究对象相似，应采用多种手段共同鉴定。此外，可以通过合理的逻辑推断找到靶关系的旁证。比如，对于已证明能够提高细胞迁移率的靶蛋白，表达目的miRNA之后，细胞迁移率应表现为降低。 ● 确认生物学功能是功能研究中最重要的模块。功能实验的量、涉及范围、技术手段及重要程度是文章意义和影响因子的决定因素。对miRNA-蛋白这种靶关系导致的生物学功能应运用多种方法，逻辑严密的设计实验验证，并可以做适当推演和尝试，考虑靶关系从长远角度或更大范畴上有可能导致什么后果，再加以尝试。此外，功能研究模块也是充分使用新技术、交叉学科技术的舞台。 总之，万变不离其宗，miRNA功能研究的骨架其实相当简单，无论是发育与分化的研究、代谢的研究还是疾病相关的研究，做好五个模块的内容，一篇miRNA功能研究的文章也就基本成型了。初入miRNA领域时，可以时常找一些miRNA文献来拆分，可以无关自身研究，也无需精读，只要了解文章做了哪些模块、各个模块之间是如何联系的即可（所谓剑意）。熟悉功能研究的脉络之后，再根据自己的课题方向来找有代表性的文章，研究其实验所用的方法和操作细节（所谓剑招），最后在动手实验的时候，对课题进程就已经了然于胸了。 |
|
|
