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关键词：代谢组学、脂质组学，肿瘤细胞系，犬尿氨 在癌症中，遗传或表观遗传变化会干扰关键酶的活性或重组致癌途径，并导致细胞代谢异常。癌症中特定的代谢依赖性是有效治疗的关键基础，寻找新型癌症药物靶点一定程度上受限于癌症代谢研究多从小部分细胞系中得出结论，但整体、全面刻画癌症代谢谱具有一定难度。现无针对来源、遗传背景全面的细胞系进行的系统分析。并且，目前也没有相关的高通量方法可以通过干扰多种细胞系的相关代谢通路来评估癌症的代谢需求，因此，新型抗癌代谢靶点的发现得益于高质量、全面的代谢数据分析。 近期发表在《Nature Medicine》上的一篇题为：The landscape of cancer cell line metabolism的文章，进一步揭示癌症代谢多样性。作者使用LC-MS对928种细胞系的225种代谢物进行分析 (来自于20多种癌症)，通过关联分析将癌症代谢与表观遗传学等有效关联。通过细胞条形码技术证实ASNS超甲基化使得胃癌和肝癌对天冬酰胺酶治疗敏感。最后揭示犬尿氨酸 (一种免疫抑制代谢物) 在模型癌细胞系中的独特合成和分泌模式。该研究结果及方法对癌症代谢提供了全面的分析，为癌症治疗奠定理论基础。  The landscape of cancer cell line metabolism 组学技术方法 代谢组学、脂质组学 研究结果 1. CCLE细胞系代谢产物组成 对主要的20种癌症类型的928种细胞系进行体外培养，并对124种极性和101种脂质进行代谢谱分析，样本分4批进行检测，使用所有样本混合作为参考，以保证数据质量。 使用层次聚类的方法评估细胞系之间代谢物组成的相似性，形成2个主要的簇与造血和非造血谱系密切相关。为进一步量化代谢物水平 (y) 与主要癌症谱系 (X) 的关联程度，采用线性回归模型进行分析。148/225与其有线性关系，为了获得谱系的特异性分布，同时评估主要癌症谱系中每一个代谢物的平均丰度，表明不同模型癌细胞系代谢谱系存在差异。 2. 代谢物与遗传特征的关系 癌症的发生与发展除了受代谢物组成变化影响外，遗传/表观遗传变化也可能改变细胞代谢，为了确定是否归因于遗传差异的代谢变异，进一步构建包括705个基因突变及61个基因扩增/缺失的遗传特征矩阵。应用线性回归模型揭示这些遗传特征和代谢物水平之间的关系。如研究发现KEAP1突变 (作为遗传特征) 与谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 和NADP+具有显著的相关性。平均而言，在具有突变KEAP1的癌细胞株中，这些氧化还原代谢产物的含量约为其对照两倍。值得注意的是，许多常见的致癌因子如EGFR、KRAS、NRAS、TP53、PTEN、TSC1/2与代谢物组成具有显著性较弱或无显著性的相关性。通过在代谢物和各种遗传特征之间进行关联分析，证实先前发现的致癌因子变化 (如IDH1、KEAP1、ME2) 与异常代谢物水平有关。 图1 CCLE数据库实现与遗传特征相关的定量代谢组学建模 3. DNA甲基化调节代谢物丰度 通过检测DNA甲基化评估其与代谢物水平的关系。在本研究中，2114个基因的mRNA与启动子CpG甲基化水平显著相关：1、DNA的超甲基化可能通过抑制某些代谢物降解途径影响代谢物水平；如SLC25A20甲基化与长链酰基肉碱 (如烯基肉碱) 的积累密切相关，其超甲基化与mRNA转录减少及具有14个、16个或18个碳原子的酰基肉碱类物质含量显著升高相关，但与其他具有较短或较长酰基链的酰基肉碱含量无关；2、DNA超甲基化可能通过限制生物合成途径来调节代谢物水平；如脯氨酸水平降低与Pycr1的超甲基化有关，Pycr1编码一种可将吡咯啉-5-羧酸盐转化为脯氨酸的酶。该部分研究工作评估DNA甲基化对于细胞内代谢物浓度的调控作用。 图2 代谢产物与DNA甲基化相关性的系统评价 4. 代谢物依赖关系分析 代谢依赖性关联分析表明，在癌细胞系中观察到的不同代谢表型与不同的基因依赖性配对，可能存在潜在的治疗靶点。作者重点关注前3000种依赖基因并突出其与氧化还原平衡、氨基酸和脂类代谢的关系。氧化还原代谢产物包括 GSH、GSSG 和 NADP+的异常积累与 NFE2L2 (NRF2) 的敲除敏感性增加有关，其中NFE2L2 是一种参与抗氧化反应的转录激活因子。同时，作者也发现天冬酰胺水平较低的细胞更依赖于其合成酶 (ASNS) 和 EIF2AK4 (GCN2，参与氨基酸饥饿反应)。通过关联分析可知体外培养的癌细胞系脂质组成具有显著差异。 图3代谢依赖关系的系统评价 5. CCLE细胞系的表型分析 如上所述，低的天冬酰胺表达水平与天冬酰胺合成酶 (ASNS) 缺失的敏感性增加显著相关。作者发现当天冬酰胺受限时，ASNS敲减可显著抑制细胞增殖。一些ASNS启动子超甲基化的CCLE细胞系具有异常低的ASNS表达 (即使在转录激活子ATF4存在的条件下)，因此作者推测内在甲基化依赖型基因抑制选择性地针对特定的营养缺乏。为进一步验证该推论，作者使用24个核苷酸barcodes标记的544种CCLE细胞系混合后在氨基酸组成明确的条件下培养，并在处理6天后使用barcode高通量测序的方法评估细胞活力。在实验中发现细胞在天冬酰胺限制条件下生长时，具有异常低表达ASNS的那些被选择性地耗尽。该部分研究工作表明DNA超甲基化影响营养物质利用的依赖性，如癌细胞系中天冬酰胺、精氨酸和谷氨酰胺的营养缺陷。 图4癌细胞系筛查揭示氨基酸代谢营养缺陷 6. 天冬酰胺酶潜在的治疗作用 作者在研究中发现天冬酰胺超甲基化的细胞同时也缺乏蛋白质表达，在体外实验中对天冬酰胺酶具有高度敏感性。为确认该依赖性是否存在于体内，作者将2313287 (ASNS high) 或 SNU719 (ASNS low) 细胞皮下植入于裸鼠两侧；当肿瘤体积达100-200 mm3后，腹腔注射天冬酰胺酶，并监测肿瘤生长情况。结果发现SNU719肿瘤的生长显著降低，而2313287肿瘤无显著变化。在TCGA中检测了胃癌和肝癌的DNA甲基化，发现其与肿瘤样本中ASNA表达量降低显著相关。以上结果均表明天冬酰胺酶在体外和体内均可通过抑制ASNS表达缺失的癌细胞生长。 图5天冬酰胺酶对胃癌和肝癌的治疗意义 7. CCLE 中的犬尿氨酸代谢分析 除了分析具有营养价值的代谢产物外，作者也探索了信号代谢产物的表达模式，如犬尿氨酸。犬尿氨酸由色氨酸分解代谢产生，通过芳基烃受体 (AHR) 发挥免疫抑制作用，从而抑制效应T细胞增殖，增强调节T细胞生成。具有较高胞内犬尿氨酸浓度的细胞系具有较高的向胞外分泌活性。 图6 CCLE中的犬尿氨酸代谢分析 小结与启示 迄今为止，暂无针对不同遗传背景的多种模型癌细胞系代谢组的系统分析，针对该问题，作者分析了928 种癌细胞系中的 225 种代谢产物，通过大规模的数据采集和分析，系统性研究了代谢物的表达模式，对药物靶点的筛选具有重要意义。同时，作者也指出在大规模代谢组学研究工作中 (本研究工作) 存在一定的局限性：1、生物学重复在大规模代谢组学研究工作中的重要性 (大部分细胞系仅使用一个生物学重复)；2、检测更多的代谢物，全面解析代谢通路 (中科新生命推出的非耙向代谢组学所使用的自建库包含2700多种代谢物的标准谱图)；3、受研究规模限制，无法使用代谢流的动态测量，只可检测代谢物的稳态水平；4、用于组织培养的培养基与体内环境仍然存在显著差异；因此肿瘤样本的大规模代谢组学分析是下一步研究的重点，相关问题提出对后续研究工作具有重要的启示意义。 中科新生命自2014年即推出代谢组学服务，是市面上最早提供代谢组学服务的平台之一，2700+代谢物标品二级谱图数据库+人工二次确认，双重保障定性结果，欢迎有检测需求的老师前来咨询。 中科新生命（APTBIO）自2004年成立以来，已建立科技服务（蛋白/修饰/代谢研究）、生物医药表征确证及精准医疗三大服务平台。APTBIO前身为中科院上海生命科学研究院蛋白质组研究分析中心（SIBS），是最早参与国际HLPP（肝脏）、HPPP（血浆）项目的平台之一，已获得CMA计量认证、邓白氏认证及ISO9001质量认证。APTBIO秉承“为人类健康事业做出贡献”的信念，整合蛋白质组、代谢组、临床诊疗及医药研发数据，为实现基础研究到临床的完美转化提供精准平台。 |
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