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栽培花生(Arachis hypogaea L.)，又称为花生，是一种重要的豆科植物，全球花生产量超过4398万吨，其果实可用作食用坚果、做食用油、花生酱、糖果等。中国和印度是两大花生生产国。 花生中最主要的一种病害是青枯病，是由青枯雷尔氏菌引起的。该病原菌通常感染植物的根部，然后通过维管束传到地上部分。如果这些细菌繁殖到一定程度，植物就会出现萎蔫症状甚至死亡。青枯病是花生生产国中的毁灭性病害，在我国13个主要花生生产省份中已被发现，并可能造成高达50-100%的产量损失。通过选育具有稳定抗性的花生品种是防治青枯病最有效的途径。通过常规育种培育了几十个抗病品种，并广泛用于花生生产。它们的抗性在植物中是最稳定和最持久的。 关于花生抗青枯病的遗传机制目前了解得很少，通过了解控制性状的遗传机制，找到候选基因，可以开发分子标记，用于基因组辅助育种，将极大地缩短育种时间，培育抗病品种。由于栽培花生(AABB，2n=4x=40)的A、B亚基因组具有很高的相似性，花生基因组大(~2.7Gb)，分子标记多态性低，因此用传统分子标记覆盖整个基因组具有挑战性大、耗时和劳动强度大等特点。因此需要更有效的策略快速定位抗青枯病的QTL，通过基因组辅助育种(GAB)，加快培育优良品种进程。 QTL-seq是一种结合了BSA及高通量测序的方法，能够快速进行QTL定位。该方法只需要对2个亲本及2个子代混池进行测序，具有高效、成本低的特点，已在豌豆、花生、鹰嘴豆等多种物种上得以应用。本研究使用QTL-seq方法对花生青枯病抗性进行了研究。 材 料 由抗病亲本Yuanza9102(RP)与感病亲本Xuzhou68-4(SP)构建的RIL群体(含195个个体)。用收获前的存活率评估其抗性。从中选取15个最低存活率的植株(2.15-11.54%)构建感病混池SB；选取存活率最高的15个(92.96%-100%)构建抗病混池。 测 序 对2个亲本及2个混池的DNA分别构建了~350bp文库，采用Illumina NovaSeq 6000进行测序，两个亲本SP、RP测序数据分别为82.25Gb、68.99Gb；两个混池SB、RB的测序数据分别为111.7Gb、110.17Gb。 研究结果 01 将reads与亲本比对鉴定SNPs 将两个混池的reads比对到SP的参考序列，抗病、感病混池的覆盖度为93.15%、93.04%；鉴定到164,522个SNPs；使用RP序列作为参考序列，抗病、感病混池的覆盖度为93.09%，92.98%；得到243,380个SNPs。 02 抗青枯病的候选区域鉴定 使用鉴定到的SNP计算了SB、RB的SNP-index，并得到了ΔSNP-index。通过滑窗分析，将SNP-index显著偏离0.5及ΔSNP-index显著偏离0的区域定位为候选区域。 本研究使用SP序列作为参考序列，在B02染色体上定位到候选区间，长度为3.35Mb(3.25-6.60Mb)；使用RP序列作为参考序列，定位到了2个候选区间，分别为B02上的3.25-6.90Mb区域及B09染色体上13.55-16.40Mb区间内的2.85Mb。 03 通过遗传图谱确认鉴定的候选区域 为了验证并缩小B02上的候选区域，对28个ΔSNP-index较高的SNP开发了KASP标记，用这些标记对RILs群体进行基因分型并构建了遗传图谱，图谱长度为38.14cm。并采用复合区间作图法对3个环境下记录的表型值进行了QTL定位，LOD值在6.53-17.23，表型解释率为14.4-29.32%；单标记分析法也证明了3个标记和青枯病抗性存在显著关联。因此，将B02上的候选区间缩小到了2.07Mb(3.74-5.81Mb)。对B09上的候选区间开发了8个KASP标记进行验证，构建图谱长度为4.86cm；但复合区间作图法及单标记分析法都证明该区间没有稳定且主效QTL；结合之前基于SSR标记研究鉴定到的5个QTLs,在B09上没有鉴定到QTL，因此认为B02上的2.07Mb区域含有抗青枯病的稳定的主效QTL，且抗性等位位点来自于Yuanza9102。 图1 花生中青枯病抗性鉴定的QTL-seq流程 04 青枯病抗性的候选基因 在这2.07Mb区域中，有348个有效SNPs，其中246个是使用两个亲本做参考序列都能鉴定到的；76、26个分别是用其中一个亲本做参考序列鉴定到的；有49个非同义突变SNPs，有19个候选基因。 在这19个发生非同义突变的基因中有7个能编码NBS-LRR型的抗性蛋白，包括Araip.G1MIP, Araip.VE4DY, Araip.05JB8, Araip.YCN52, Araip.U0YME, Araip.WF303 和Araip.65IVT。 图2 鉴定的与青枯病抗性有关的NBS-LRR抗性蛋白 05 诊断标记的验证 用位于B02上2.07Mb基因组区域上的3个SNP标记对21个抗病材料和9个感病材料进行验证(材料由抗病品种Yuanza9102和感病品种Zhonghua5杂交得到)。有2个标记(Araip_B02_3740746 和 Araip_B02_5804063)能够将抗病材料和感病材料分开。标记Araip_B02_3740746在抗病亲本中扩增出来CC等位基因型，在感病亲本中扩增出AA等位基因；第二个标记Araip_B02_5804063在抗病亲本中扩增出GG等位基因型，在感病亲本中扩增出TT等位基因型。所有21个抗病材料都为CCGG基因型，而9个感病材料为AATT基因型。然后对由Yuanza9102与其它两个抗病亲本得到的2个抗病材料进行鉴定，发现他们都含有CCGG基因型；而对其它的13个感病材料和13个抗病材料进行鉴定，发现他们都扩增出了AATT基因型。说明来自于Yuanza9102的抗性等位基因可能与其它13个抗性材料的不同。 然后根据这两个标记将RILs群体分成了CCGG、AATT基因型的两类，发现59个CCGG型的材料的平均存活率为74.45%，要显著高于78个AATT型的(34.17%)。表明来自Yuanza9102的抗性等位基因能够显著提高花生青枯病抗性。通过上述研究，表明Araip_B02_3740746、Araip_B02_5804063这两个标记对于培育具有青枯病抗性的材料是有用的。 图3 青枯病抗性诊断标记的验证 1、使用了2个亲本的参考序列对2个混池进行分析，提高了定位的准确性；结合连锁分析，进一步验证了定位结果并缩小了候选区间。 2、成功定位到了青枯病的候选区域，且开发了诊断标记，有利于加快花生抗青枯病品种的分子育种。 微分基因是一家借助于国际领先的高通量测序平台，为生命科学研究和基因检测提供整体解决方案的高新科技企业。致力于将生命科学研究和健康管理与疾病诊疗领域的测序数据进行产业化应用，推动基因科技成果转化。 2017年3月，微分基因入驻国家大基因中心，成为国家大基因中心“基因检测平台”运营企业，并成立安徽微分基因科技有限公司。8月，位于安徽巢湖的标准洁净实验室及医学检验所启动运营，占地约2100平方米。10月，全贯穿的基因检测平台、大数据处理平台、高通量自动化样本处理平台、一流的生物样本库开始正式运作。 在生物医药晋升为“ 国家战略性新兴产业” 的行业背景下， 微分基因依托独具优势的高通量基因测序和大数据挖掘技术， 为各大高校、医院、科研单位以及第三方健康管理服务平台， 提供专业的基因检测和数据分析解读服务。 健康|医疗|基因|科普 微分基因科技服务 |
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