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高通量测序技术揭示短期无血清培养不会导致人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）明显的mtDNA突变 Short-term serum deprivation causes no significant mitochondrial DNA mutation in vascular smooth muscle cells revealed by a new next generation sequencing technology 发表期刊：Acta Biochimica et Biophysica Sinica（2016年） 影响因子：2.502（2018年影响因子） 技术手段：VariantPro™线粒体试剂盒（联川提供） 文章创新点：第二军医大学顾明君教授带领的科研团队首次将联川的VariantPro™多重PCR靶向捕获测序技术运用到临床疾病的研究当中。研究结果充分显示出VariantPro™多重PCR靶向捕获测序技术高覆盖度、高均一性、高准确性的性能。这也暗示了VariantPro™技术可进一步运用于人类疾病研究。 研究背景 线粒体是细胞内产生能量的细胞器，线粒体发生紊乱几乎可以影响所有机体组织[1]。线粒体DNA (mtDNA)为环状双链DNA分子，全长16569 bp，由37个基因和1个D-Loop区组成。不同生物的mtDNA都以蛋白质-DNA复合物形式存在，与原核细胞DNA的组织结构相似，称为线粒体类核。线粒体类核是线粒体基因组的功能单位，具有基因复制、转录和修复的功能[2]。尽管线粒体类核具有几乎所有已知的核DNA修复途径，但起保护作用组蛋白的缺乏，可能使其对应激和DNA损伤有特殊的敏感性[3]。 据报道，mtDNA具有很高的突变频率[4]，已成为人类疾病包括糖尿病、心血管疾病、癌症、神经肌肉疾病和衰老发生的重要原因，发病率为1/4300 [5,6]。 图1. 线粒体呼吸链 血管缺血是许多血管相关疾病的常见现象，如糖尿病、早衰、心血管疾病和癌症。缺血对各种类型的细胞都有强烈的应激作用，这种应激可以刺激血清剥夺反应因子[7]、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路[8]和其他等[9]，从而产生严重的生物学后果。因此，缺血可能是这些血管疾病的驱动因素或恶化因素。 目前，缺血是否会通过引起mtDNA突变导致血管疾病尚不清楚[10]。血管平滑肌细胞(SMC)是动脉疾病发生的主要原因之一。体外培养的血管SMCs对血管疾病的研究具有重要意义，可作为动脉疾病新的治疗靶点。 本实验采用NGS测序技术，使用联川生物VariantPro™线粒体全长基因筛查试剂盒，鉴定血清剥夺条件下人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)中可能存在的mtDNA突变。在对照组和无血清组中随机挑选3个浓度约为5-10ng的DNA样本参与VariantPro™捕获，最后在Hiseq 4000平台上进行测序。 样本来源：将HASMC(美国ScienCell)放在含有4.5g/L葡萄糖，10mm厚，添加10%胎牛血清和1％青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，放置在37°C，含5%二氧化碳的加湿孵化器中。当细胞融合达到80%-90%时，实验组对细胞进行5h无血清培养。对正常培养的细胞和无血清培养的细胞进行DNA提取。 1. 线粒体测序数据 在评定高通量测序数据准确度中，Illumina对Q30的标准是>75%，而本研究中高通量数据Q30>94%，测序质量可信度高。此外，VariantPro™ 线粒体全长基因筛查试剂盒捕获的所有扩增子的平均覆盖度大于0.2×Mean，大部分（>86.83%）扩增子的覆盖度差异倍数在1个log之内，说明文库均一性比较好，文库质量比较高。这也证实VariantPro™靶向测序文库制备技术效果很好，测序结果可靠。 图2. Amplicon覆盖均一性高达100% at ≥0.2×Mean 2. 线粒体基因突变 测序结果与线粒体基因组比对，以筛选出可能的突变。研究人员分析了对照组和实验组样本中的单核苷酸多态性（SNP），插入，缺失，以及所有线粒体基因的相关突变频率。结果发现有3个基因插入或缺失，12个基因有SNP。这些突变同时发生在对照组和实验组样本中，两者之间没有显著的差异。 图3. mtDNA基因突变频率 作者在之前的实验中发现，能量变化与血清剥夺有关（数据未显示），因此对HASMC进行血清剥夺可能会导致mtDNA突变。实验结果表明，血清剥夺5小时的细胞中未发现任何mtDNA突变，表明短期（<5小时）缺血可能仅导致线粒体RNA或蛋白质水平的变化，但不会导致mtDNA水平的突变。延长血清剥夺时间（如24或48小时），可能导致mtDNA突变，这需通过进一步实验确认。 在对照组和实验组中均检测到mtDNA突变，没有发现显著差异，表明正常条件下也会出现mtDNA突变。该结果对于mtDNA突变的研究非常重要，除需使用线粒体标准参考基因组，也应对每个实验的对照组进行测序，以鉴定mtDNA突变。 在基因表达研究中，细胞转染是一种通用技术，血清剥夺是常规操作。本研究中未发现短期缺血培养下，HASMC中的任何mtDNA突变，这意味着细胞转染实验中的血清剥夺对基因表达的研究是安全可靠的。 综上所述，本研究介绍了一种新的NGS技术——VariantPro™来研究短时间血清剥夺条件下HASMCs中mtDNA的突变。正常细胞和无血清细胞中mtDNA突变无明显差异，提示VariantPro™技术可用于进一步研究缺血的生物学效应。 1. Wallace DC.Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.Environ Mol Mutagen 2010, 51: 440–450. 2. Akhmedov AT,Marin-Garcia J. Mitochondrial DNA maintenance: an appraisal. Mol Cell Biochem 2015, 409: 283–305. 4. Wallace DC, Chalkia D.Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution anddisease. ColdSpring Harb Perspect Biol 2013,5: a021220. |
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