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在细胞的生命活动过程中，多种内外源因素时刻威胁着基因组的稳定。这些因素会造成DNA产生多种类型的损伤，而其中最为棘手的便是DNA双链断裂（double strand break，DSB）。面对这种严重的DNA损伤类型，细胞并不会束手待毙，一套精密的损伤修复系统——DNA双链断裂修复（DSB repair，DSBR）会高效修复这种损伤以求对细胞造成的损失降到最低。DSBR又可分为两大类，一类依赖DNA复制时姐妹染色单体上的同源序列指导修复的精确进行，称为同源重组（Homologous recombination, HR）；另一类则不依赖同源序列，直接将断裂末端彼此相连，往往造成DNA片段的插入或缺失，称为非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）。 复制叉崩溃、自身程序化的链断裂、活性氧、病毒感染、电离辐射、某些化合物或是基因编辑技术使用的核酸酶都会是DSB发生的诱因。然而，在各种生理或病理情况下，DSB产生与修复间的平衡、HR与NHEJ通路间的平衡都常常发生着动态变化。在这种动态变化过程中，细胞若无法及时、精确地修复DSB将会造成早衰或者肿瘤发生等恶劣影响。为了能够准确定量地同时分析染色质特定位点的HR与NHEJ效率及其之间的选择与平衡，发展一种高效又精准的检测手段非常重要。 同济大学附属第一妇婴保健院、生命科学与技术学院毛志勇教授课题组长期致力于衰老及相关疾病如肿瘤相关的DNA损伤修复的研究工作。2019年7月10日，Nucleic acids research在线发表了毛志勇教授课题组题为A PARP1-BRG1-SIRT1 axis promotes HR repair by reducing nucleosome density at DNA damage sites的工作。该研究建立了一种基于红色和绿色荧光、易于量化的新型DSBR检测手段，利用该方法，研究团队深入阐述了PARP1-SIRT1-BRG1信号轴在HR修复中的染色质密度调控功能。 首先，团队成员基于绿色荧光蛋白GFP与红色荧光蛋白tdTomato构建了一种双报告载体并将其整合至细胞系中。在通过外源转入内切酶I-SceI从而诱导载体发生定点DSB后，若细胞成功通过HR修复了损伤，细胞会发出红色荧光；若通过NHEJ将断裂末端彼此相连，细胞则会发出绿色荧光（图1）。利用流式细胞技术，研究者便可同时定量分析成功发生HR或NHEJ修复的细胞比例，并得知细胞修复该位点损伤时在这两种修复方式中选择的偏好性。 图1：双报告载体工作模式图 接着，研究团队将该报告载体整合至染色质不同位点建立了若干不同的细胞克隆。通过修复效率分析发现不同位点的HR及NHEJ修复效率存在较大差别，而其中HR效率在不同位点间更是存在着近72.6倍的巨大差异。进一步研究表明，这些位点的核小体密度与HR效率、HR/NHEJ偏好性均存在显著负相关。此外，损伤发生后，断裂位点邻近区域的核小体密度也显著降低。这些结果提示较为松散的染色质环境有利于HR修复的进行。 与DNA修复密切相关的多聚ADP核糖聚合酶PARP1曾被报道参与转录过程与NHEJ或核苷酸切除修复过程中染色质结构的调节，但其是否同样参与HR过程中染色质密度的调控还不为人知。研究团队证实PARP1敲除或利用PARP1抑制剂处理细胞将弱化损伤发生后断裂位点附近核小体的清除过程，进而影响HR相关因子RPA2及RAD51招募，最终降低细胞的HR修复效率；而这一现象可被氯奎或VPA诱发的染色质松散作用所拯救。后续深入的机制研究表明：损伤发生后，由PARP1催化产生的多聚ADP核糖链会通过与去乙酰化酶SIRT1的ZNF结构域及与ATP依赖的染色质重塑因子BRG1的ATPase结构域分别发生相互作用，从而招募其到达DSB位点。在损伤位点，SIRT1对BRG1的1029及1033位赖氨酸进行去乙酰化从而增强其ATPase活性，促进其松散损伤位点附近的核小体结构以推动HR修复进行（图2）。 图2：PARP1-SIRT1-BRG1通路调控HR修复模式图 毛志勇教授课题组的该研究成果，为研究者今后精确测量不同时空条件下细胞内DSBR效率，特别是同一染色质位点HR与NHEJ的选择与平衡提供了强有力的新方法。此外，该工作还深入阐述了HR修复过程中PARP1-SIRT1-BRG1信号轴对核小体密度的调控作用，提示PARP1在HR修复中亦扮演重要角色。值得注意的是，该工作的初步研究结果还预示着PARP1抑制剂在HR通路激活的肿瘤类型的治疗中也存在潜在的重要应用价值。 原文链接： https://academic./nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkz592/5530672?searchresult=1 制版人：珂 |
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