TIL对战实体瘤，锋芒初露？

今年的ASCO除了大火的KRAS小分子外，最大的赢家莫过于Iovance Biotherapeutics的TIL（肿瘤浸润淋巴细胞）疗法LN-145。前几日FDA已经承认，正在进行的innova TIL-04研究可能足以支持晚期宫颈癌患者的治疗登记。这就意味着，治疗实体瘤的细胞疗法将在TIL疗法中诞生！

然而与如日中天的CAR-T疗法相比，TIL疗法依旧显的默默无闻，参与的玩家和资本都非常之少，虽然两项技术都是出自NCI的Steven A. Rosenberg老先生之手。

一、TIL疗法的研究发现阶段

1986年Rosenberg等从小鼠肿瘤中分离出了浸润淋巴细胞，将它在体外用IL-2扩增到一定数量后，重新输回到长瘤的小鼠体内，能够有效地控制肝、肺转移灶的生长，甚至可使有些小鼠的转移灶和原发灶的肿瘤完全消退。

Rosenberg认为在手术切除的肿瘤组织中，虽然大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。这些淋巴细胞中有部分是针对肿瘤特异性突变抗原的T细胞，是深入到敌军内部打击能力最强的免疫细胞，但是由于一些原因(比如肿瘤微环境)，他们的功能受到了抑制，不能在肿瘤组织中有效的杀伤肿瘤细胞。

接下来Rosenberg采用该疗法治疗了黑色素瘤患者，并于1988年在新英格兰医学杂志发表了试验结果。15名转移性黑色素瘤患者在使用TIL细胞联合IL-2以及环磷酰胺治疗后，9位产生了客观应答，缓解时间为2-13个月。该临床试验首次证实了TIL治疗转移黑色素瘤的疗效。

虽然TIL疗法在发现之初确实惊艳过大家，但自发现的这这些年以来确实很少人获益，主要有以下几个原因：

1.TIL针对黑色素瘤患者仅部分有效，TIL里面也有Treg细胞，早期的扩增后回输,大部分是Treg还有其它免疫抑制环境，导致效果并不好

2.最初的TIL疗法无法保证回输的T细胞在体内能存足够的时间，通常输入后的很短时间里，就消失的无影无踪，因此不能产生足够的疗效

3.早期的TIL体外扩增技术不成熟，养出的TIL细胞数还远远不能满足于临床应用，而且早期的扩增技术不能保证每个患者的TIL都可以进行扩增。但随着Topalian等提出一种快速扩增法REP(rapid expansion protocol)，才可以使以使TIL细胞在短期内达到109~1010数量级

4.TIL疗法通常伴随着使用高剂量的IL-2，具有显著的不良反应

5.从肿瘤组织切除，到T细胞快速扩展至回输需要的数量，通常需要5~6周的时间，排除了一部分疾病快速进展的患者试用这种疗法。

6.针对其他实体瘤效果并不好，之前仅局限在黑色素瘤患者 

总的来说：TIL在实验室较长的生产过程、TIL疗法涉及的多种系统用药、回输后副反应的管理，都在一定程度上将这个疗法长时间限制在研究机构的院墙内。 

二、 TIL疗法的产业化——Iovance Biotherapeutics

Iovance Biotherapeutics，于2011年从NCI的Rosenberg团队引进了经典的TIL技术，在与NCI的合作研发协议下，集中精力通过对TIL的生产工艺进行简化、规模化，目标是开发出可以商业化的TIL细胞治疗产品。 

★ TIL.1.0版本

Iovance Biotherapeutics疗法lifileucel产品基本操作：

1.患者在医院里接受手术，切下来的肿瘤组织立刻运送到Iovance Biotherapeutics在各大城市建立的GMP实验室，提取T细胞进行后续的处理和培养；3周之后，TIL细胞培养成熟，再运回医院，回输给病人；

2.在接受TIL回输前一周，患者要接受大剂量化疗的预处理，用的化疗药是环磷酰胺 氟达拉滨；（消除免疫耐受环境）

3.在TIL回输后，再接受6个疗程的白介素2静脉注射，每次60万个单位/kg。

读到这，其实聪明的读者应该了解到按照Rosenberg的TIL.1.0细胞的治疗流程，回输的TIL细胞其实是很多细胞的混合体，并没有经过很特异的筛选。有些TIL细胞是对肿瘤特异的，有些并不是特异的。

为了提高有效率，Rosenberg接下来研究了一下这些混合的细胞里到底哪种特定类型的细胞才是肿瘤特异的，于是就做了更加精准的TIL.2.0 版技术。

★  TIL.2.0版本

和上篇我们的《新生抗原：新生曙光？》中的做法类似：

1.预测新生抗原：NCI先利用患者正常细胞的基因组作为对照，通过全外显子测序（WES）和RNA测序发现了患者的癌细胞存在的体细胞突变，然后用MHC分子-抗原表位亲和力算法进行模拟预测出新生抗原

2.制作新生抗原的mRNA或者多肽

3.将来自患者的肿瘤组织被切分为多个小块，高剂量的IL-2培养11天

4.筛选TIL细胞：用抗原呈递细胞（APC）把这些人工编录的肿瘤特征（多肽或者mRNA）展现给各个TIL组分，以供它们识别

5.特异性筛选：被激活的T细胞组分会释放大量的IFN-γ，并在表面表达4-1BB

6.快速扩增（REP(rapid expansion protocol)）：使用OKT3(anti-CD3)抗体、IL-2以及经过辐照灭活后的健康供者的单个核细胞作为饲养细胞进行刺激

当然除了直接从肿瘤切片组织获取TIL之外，为了解决一些患者新鲜肿瘤样本的有限可用性，Rosenberg在15年首次从患者的外周血单核细胞中成功分离出与突变表位反应的T细胞（虽然这类细胞在所有外周CD8 T中可能占比不过0.5%）

通过上面方法这样筛选出来的TIL细胞就是能够针对特异性识别肿瘤的“精英部队”，举个例子来说，

大约有三个来自肿瘤组织的TIL组在APC共培养后因高反应活性被筛选出来。TCR分析显示，这些来自肿瘤组织的T细胞组分包含有8种TCR类型，他们可以识别患者的2种肿瘤新生抗原。

虽然费尽周折收获的TCR多样性只有8种，看起来不算非常多，但在接受TIL治疗前的外周血血样中，这位患者只有这些TCR类型中的2种，而且对肿瘤新生抗原的反应性则仅限于1种抗原。

有意思的是：患者在回输后6周甚至17个月时，外周血仍可检测到全部8种TCR类型。而回输后随访过程中，患者的外周血中又检测出了另外3种对肿瘤新抗原具反应活性的TCR类型，从而使得可以识别的肿瘤新抗原增加到4种TCR。这可能是表位扩展（epitope spreading）现象，肿瘤细胞死亡破碎后，被APC细胞识别了更多的肿瘤新抗原。

三、TIL对战实体瘤，锋芒初露？

根据Nature Reviews Drug Discovery上的一篇文章，虽然全球约90％的癌症病例是实体肿瘤，但自1993年以来已开始的细胞治疗试验中只有约一半(1,203项试验中的596项)针对实体肿瘤，并且大多数针对实体瘤的细胞治疗试验集中在少数肿瘤类型 - 如黑色素瘤(79项试验)、大脑和中枢神经系统癌症(75项试验)和肝癌(57项试验)，许多实体瘤类型没有进行任何专门的细胞治疗试验。

与CAR-T的“百家争鸣”不同的是,TIL疗法的推动几乎全靠NCI的Rosenberg课题组，没有其他的科学大牛或者大药企在这个领域下重注，这也许算是CAR-T“弯道超车”的因素之一。

但这丝毫不影响Iovance的LN-145近期的光芒：

★ 宫颈癌II期临床：这项临床试验入组的是至少一线治疗失败的晚期宫颈癌患者，一共27名患者疗效可评价，这些病人在入组前中位接受过2.6种方案的治疗后疾病依然进展。中位随访了3.5个月后，结果显示：TIL治疗的有效率为44%，疾病控制率为89%，其中1名患者肿瘤完全消失，9名患者肿瘤明显缩小，2名患者肿瘤明显缩小但疗效有待进一步证实。

★ 复发难治性黑色素瘤：55名极端难治的晚期恶性黑色瘤患者入组了临床试验，接受了TIL治疗，结果显示：有效率为38%，其中包括1名患者肿瘤完全缓解、19名患者肿瘤明显缩小，疾病控制率为76%。其中包括不少是PD-L1阴性、PD-1抗体治疗刚刚失败的患者。

与CAR-T在实体瘤里艰难挣扎不同的是，TIL细胞疗法已经在乳腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、头颈部鳞癌等多种实体瘤中取得了成功的案例。肿瘤的异质性问题注定会让CAR-T疗法在实体瘤中艰难前行，而似乎更恰当的方式就是多种抗原共同发力，而肿瘤新生抗原似乎是老天恩赐的宝贝，既高效，又安全。

但TCR-T或者TIL疗法也有个潜在的问题就是这两种疗法都需要癌细胞保留呈递该抗原的MHC分子，不巧的是，肿瘤通过这种丢失MHC基因座逃逸免疫系统的可能性也很高。

如果说CAR-T疗法拉起了细胞治疗序幕，在血液瘤里大放光彩，那么到如今，不得不承认TIL疗法在实体瘤里崭露头角，开始接力。

参考文献：

1.Stevanović, Sanja, et al. 'A Phase II Study of Tumor-infiltrating Lymphocyte Therapy for Human Papillomavirus–associated Epithelial Cancers.' Clinical Cancer Research 25.5 (2019): 1486-1493.

2.Zacharakis, Nikolaos, et al. 'Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer.' Nature medicine 24.6 (2018): 724.

3.Cohen, Cyrille J., et al. 'Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes.' The Journal of clinical investigation 125.10 (2015): 3981-3991.

4.Cohen, Cyrille J., et al. 'Isolation of neoantigen-specific T cells from tumor and peripheral lymphocytes.' The Journal of clinical investigation 125.10 (2015): 3981-3991.

5.肿瘤浸润T细胞疗法（二） | 边研，研发客

（完）