10x Genomics单细胞转录组测序Tips

目前，10x Genomics单细胞平台凭借自身技术优势和成熟商业化逐步受到广大科研人员的青睐，利用10x Genomics平台发表的单细胞转录组文章已超过300篇，其中2019年至今已发表近百篇。10x Genomics单细胞转录组测序策略大大提高了通量，降低了成本，但由于整套体系基于无差别微流控分选，细胞悬浮液的质量从很大程度上决定了实验的成败。今天天津生物芯片就为大家总结几条上机样本预处理Tips，从源头上帮助大家提高成功率

1，样本制备

尽快解离获得的新鲜组织样本，制备成细胞单分散悬浮液，若时间不允许，可使用组织保存液对其进行低温运输或保存，保存条件为4 ℃冷藏但不可冻结，保存时间最多48 h；

建议通过预实验优化不同类型组织酶解的最佳条件，以提高组织解离获得的细胞总数量；

细胞团、组织碎片或细胞碎片会导致计数不准确，杂质颗粒可能会造成芯片上的微流通道被堵塞，致使GEM制备失败，应使用细胞滤筛、死细胞去除（磁珠）试剂盒、碎片去除试剂盒等提高样本纯度和活性；

若样本含有大量的红细胞，应使用红细胞裂解试剂进行红细胞去除；

仪器捕获率为65%，上机分选样本需要根据细胞浓度和目标捕获数计算，并将样本浓度尽量调至官方推荐最佳上样浓度范围（700-1200 个/uL）。

2，样本保存

制备好的样本应时刻置于碎冰上保持活性等质量，细胞悬浮液确定达标后应尽快上机（<30 mins），敏感脆弱细胞类型尤其需要注意实验时间；

推荐将样本重悬于1x PBS（无钙镁）+0.04% BSA环境中（清洗也使用此体系），经官方验证可对细胞进行重悬的替换Buffer或培养基如下所示：

几乎无影响：DPBS、HBSS；

影响较小：EMEM+10% FBS、DMEM+10% FBS、IMEM+10% FBS、RPMI+10% FBS、Ham's F12+10% FBS、1:1 DMEM/F12+10% FBS。

3，实验细节

上机前应进行样本清洗，细胞数目特别少时，可仅离心清洗一次，但必须保证去除钙镁离子和EDTA，建议使用宽口枪头吹打细胞以保证活性，可向PBS中添加0.04% BSA减低细胞结团率；

离心回收细胞时，一定要使用可控温平转子离心机，并调低离心机减速时的加速度（4-5），根据细胞尺寸大小等特征调节转速和时间（一般不超过400 Xg，5 mins）。

4，生信分析流程

测序数据质量统计（比对基因组、基因表达定量）→ 细胞过滤与标准化→ 细胞亚群分类 → 差异基因筛选 → 差异基因功能分析（GO、KEGG）→ 标记基因筛选

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