Nature Commun. | 中国农业大学利用基于TurboID邻近标记技术鉴定出新的植物免疫受...

蛋白-蛋白相互作用 (protein-protein interactions, PPIs) 是细胞生命活动的基础，也是整个生物学领域研究的核心问题之一。传统互作蛋白筛选技术如酵母双杂交筛选需要文库的构建，且酵母细胞作为单细胞真核生物与与高等真核多细胞生物如植物细胞存在差别。类似的，亲和纯化串联质谱分析技术 (AP-MS) 不能有效地捕获瞬时的或较弱的蛋白相互作用，也不适用于低丰度的蛋白或疏水性较强的膜蛋白，且无法分辨蛋白相互作用发生的细胞内定位信息，存在较多的限制。然而，许多重要的蛋白，如在植物免疫反应过程中发挥关键作用NLR受体类蛋白往往具有上述特征，利用传统手段研究上述蛋白的相互作用效果往往不理想。

近年来，以BioID, APEX和TurboID为代表的蛋白质邻近标记技术逐渐被应用于蛋白质相互作用研究【1-3】。邻近标记 (Proximity labeling, PL) 的原理是将一个具有邻近标记功能的酶 (biotin ligase) 与目标蛋白融合，通过酶催化的共价修饰将邻近的蛋白标记上生物素，最后通过亲和素磁珠富集生物素标记蛋白进行质谱鉴定 (Fig. 1)。虽然动物系统中已有若干利用邻近标记技术研究蛋白互作的报道，但是邻近标记技术是否适用于植物系统，这方面的研究极少。

Fig. 1 邻近标记原理示意图

2019年7月19日，Nature Communications在线发表了中国农业大学张永亮课题组、加州大学戴维斯分校Savithramma P. Dinesh-Kumar课题组和爱荷华州立大学Justin W. Walley课题组合作题为“TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity”的研究论文。该研究首次在植物中建立了基于TubroID的邻近标记体系，并成功应用于抗烟草花叶病毒(TMV)免疫受体蛋白N的互作蛋白研究。

植物NLR (nucleotide-binding leucine-rich repeat, NLR) 免疫受体类蛋白在介导效应因子激活的免疫反应 (effector-triggered immunity, ETI) 中发挥关键作用。尽管已有多种植物NLR受体被鉴定，但人们对于对于植物如何调控NLR受体介导免疫反应仍然知之甚少。

基于此，张永亮课题组与加州大学戴维斯分校和爱荷华州立大学的研究人员合作，对经典的N蛋白介导的植物免疫开展了研究。该研究首次比较了现有的不同邻近标记连接酶BioID, BioID2和TurboID在植物中的表现，研究结果表明TurboID的标记效率和特异性明显优于BioID和BioID2，在此基础上，该研究首次在本生烟 (Nicotiana benthamiana) 中建立了基于TurboID邻近标记技术体系 (Fig. 2).

Fig. 2 本生烟 (N.benthamiana)中基于TurboID的邻近标记技术流程示意图.

利用上述建立的邻近标记体系，进一步对N介导的抗TMV免疫反应中可能与N发生互作的蛋白进行了分析，鉴定到大量可能与N发生互作的蛋白，这其中有一蛋白为UBR7，该蛋白在N-末端规则(N-end rule)蛋白酶解途径中发挥作用，其在酵母、动物和植物中高度保守，但是功能研究极少。进一步研究表明UBR7在N介导的抗性免疫反应中发挥重要功能，是一新的植物免疫受体负调控因子。以上邻近标记技术在植物体系中的应用为鉴定植物中新的蛋白质-蛋白质相互作用提供了新的技术手段。同时该研究鉴定到的UBR7这一新的植物免疫负调控因子对于广谱抗病作物的开发具有重要的潜在意义。

中国农业大学张永亮副教授为该论文第一作者和共同通讯作者，加州大学戴维斯分校Savithramma P. Dinesh-Kumar教授和爱荷华州立大学Justin W. Walley博士为该论文的共同通讯作者。

参考文献：

1. Roux,K.J., Kim, D.I., Raida, M., and Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusionprotein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journalof Cell Biology, 2012, 196: 801-810.

2. Rhee,H.-W., Zou, P., Udeshi, N.D., Martell, J.D., Mootha, V.K., Carr, S.A., and Ting,A.Y. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science, 2013, 339: 1328-1331.

3. Branon,T.C., Bosch, J.A., Sanchez, A.D., Udeshi, N.D., Svinkina, T., Carr, S.A.,Feldman, J.L., Perrimon, N., and Ting, A.Y. Efficient proximity labeling inliving cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology, 2018, 36: 880–887.