我国历次结核病流行病学调查资料显示,非结核分枝杆菌(NTM)分离率从1990年的4.9%升至2000年的11.1%,2010年为22.9%,NTM的分离率持续增高,这基本反映出我国NTM病呈明显上升的态势,并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题。NTM鉴别诊断较为困难,临床上NTM肺病与肺结核在症状、体征及影像学表现方面均具有很大的相似性,但无论从病原学还是治疗上,都与肺结核有一定的区别。NTM肺病无法通过痰分枝杆菌抗酸染色进行鉴别,要明确病原学诊断须进行菌种鉴定,而采用经典的痰培养及菌种鉴定方法需要8周左右的时间。在临床工作中,很多肺部疾病患者最初诊断为“肺结核”,但数周过后,菌种鉴定报告却提示为NTM生长,且对几乎所有的一线抗结核药物均耐药,因而不得不调整或更换所有的治疗方案。 source | flaticon 一、什么是非结核分枝杆菌? 非结核分枝杆菌(NTM)指除MTB复合群和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌总称,是一种环境生长菌,在自然界广泛存在,目前全世界已发现NTM约154种,但只要少数是致病菌,属于条件致病菌,主要侵犯肺部,近年来国内NTM病发病率不断增加,以鸟复合分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌最为常见。从对临床指导意义考虑,将NTM简单分为快生长分枝杆菌(RGM)和慢生长分枝杆菌(SGM),即可对用药选择提供有益信息。临床最常见的有临床价值的RGM包括脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌,RGM感染通常选用大环内酯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等药物治疗。最常见的有临床价值的SGM包括鸟分枝杆菌复合群(MAC,主要包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)、堪萨斯分枝杆菌及蟾蜍分枝杆菌等,治疗通常选取大环内酯类和利福霉素类药物,有时候加用注射类抗结核药物。 二、常用的NTM鉴定方法 由于各大医院对于非结核分枝杆菌的诊断水平和标准参差不齐,误诊率较高,为促进实验室NTM检验水平的提高,同时提高临床医生对实验室结果的正确认知,中华医学会结核病学分会组织流行病、临床和实验室领域专家就NTM相关实验室诊断领域的重要问题进行讨论,2016年撰写了最新的《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》。
文中指出,传统的根据生化和鉴别培养基进行菌种鉴定的方法不但耗时,而且不能完全将许多NTM菌种鉴定出来,因此已不常用。 现阶段常用的临床菌种鉴定方法有以下几种: 1. 对硝基苯甲酸(PNB)选择性培养基法 此方法在我国广泛开展,NTM可在含500 mg/L PNB的罗氏培养基上生长,而MTC不耐受,较多结果表明此方法可用于鉴定MTC和NTM。 2. MPT64抗原检测法 MPT64抗原是MTC在液体培养基中生长时主要分泌的蛋白之一,NTM培养滤液中多不存在此分泌蛋白,由此可以进行初步菌种鉴定。检测方法大多采用免疫层析法检测培养滤液中MPT4抗原是否存在,具有操作简单、用时短等优点。此技术具有很高的敏感度(多数报道超过97%)和特异度(多数报道超过97%)。 3. 核酸扩增实验 PCR技术,结核病诊断的PCR试剂盒扩增的靶序列往往是MTC中特异性的DNA序列,如IS6110、MPT64、ESAT-6及CFP-10等。将PCR技术与涂片和培养结合可用于NTM的初步筛查。对于涂片阳性或是培养阳性的标本,平行的PCR扩增获得阳性结果提示样品中存在MTC菌,反之,当PCR为阴性结果时,应考虑存在NTM的可能,但需要进一步核实。 4. 分子诊断技术 同源基因或序列比较,通过分析同源DNA序列组成差异鉴定细菌至种水平,可用于菌种鉴定的DNA序列既要求在不同的菌种间具有较高的序列保守性,实现应用通用引物对不同菌种目标序列的扩增,又要求不同菌种的同源序列具有一定水平的差异,以实现鉴别区分的目的。目前最常用的同源序列有16S RNA编码基因(16S DNA)、16S-23S rRNA基因间区(ITS)、RNA聚合酶的β-亚基(rpoB)和热休克蛋白65(hsp65)的编码基因。 5. 依据细菌结构差异进行菌种鉴定 高效液相分析细胞壁的分枝菌酸碳链结构和蛋白成分在菌体中的比例。细菌的脂质和蛋白质的组成具有种属特异性,这2种方法均已经建立了包含丰富菌种的图谱库用于结果比对,因此具有很高的鉴别能力。 以上方法均用于临床分离株的鉴定,因此不利于临床的及时诊断,在我国NTM分离率不断提高情况下,迫于各种不利因素,急切需要一种方法利于快速、省时、方便、可信度高的方法用于菌种鉴定。 三、药物敏感性分析 source | flaticon 1. 药敏性实验 虽然美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)对于一些NTM菌种有推荐的药敏试验方法和药物临界浓度,但这些方法仍有待临床充分地评价和调整。开展没有推荐方法的菌种的药敏试验时,常规做法是慢生长分枝杆菌多参照MTB选取临界药物浓度,而快生长分枝杆菌多参照普通细菌选取临界药物浓度。但不同种的分枝杆菌的耐药临界浓度可能存在明显差异,因此需要开展更多的临床和基础研究,以建立针对不同菌种的药敏试验方法。从目前已获得的数据来看,NTM感染的治疗效果主要取决于菌种,如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的疗效较好,而MAC、脓肿、龟分枝杆菌的治疗疗效较差,表明种属对药物的敏感性至关重要。只有同一菌种不同菌株对药物的敏感性存在分化时,才有必要开展药敏试验。 2. 耐药性分子诊断 NTM和MTC有相同或类似的药物靶位,但NTM对很多抗结核药物天然耐药,表明NTM细胞壁通透性、药物外排泵、药物与靶位的低亲和力等其他因素较基因多态性在NTM耐药中发挥着更为重要的作用。临床上对于结核分枝杆菌的分子检测是比较明确的,但非结核分枝杆菌现在只有个别的一些菌株我们能检测到,如MAC耐大环内酯类药物与23S核糖体RNA基因(rrl)的基因突变高度相关;16S核糖体RNA基因(ITS)突变与脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌对阿米卡星耐药相关;rpoB基因突变与堪萨斯对利福平耐药相关。有限的研究结果提示,一些已知基因的单核苷酸多态性可能与耐药有关,但现有的数据仅报道了个别药物中较低比例的耐药菌株可能与某一基因的序列多态性有关,因此,未来耐药分子机制方面有待更深入的研究,才有助于未来应用分子手段尽快发现耐药菌株。 四、宏基因组测序应用于NTM检测及药敏性分析 随着二代测序(NGS)、三代测序技术的广泛应用,宏基因组测序发生了巨大变化,在获得海量数据后,能够快速、全面的分析病原体群落结构。 宏基因组学是以某一特定环境样品中的病原体基因组为研究对象,以测序分析的手段,以病原体多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的病原体研究方法。宏基因组测序直接从样品中提取基因组DNA后测序分析,将所测序列与专业数据库对比,得出样本中所含物种信息:通过严格的宏基因组拼接,获得较长的DNA片段;若测序达到一定的通量可获得一个或多个病原体基因组草图;在此基础上进行功能分析及病原体群落结构和多样性分析。 目前该技术已广泛应用于工业生产、食品安全、医学研究及临床诊断等领域,在临床上的应用如感染类型诊断、耐药和敏感分析、传染病的防控等。该方法的应用在临床上对病原体检测、预测对药物敏感性方面已经取得了进展。 随着科学的进步与医疗的发展,我国结核病疫情逐步得到控制,而我国的非结核分枝杆菌感染问题却越来越突出,临床对NTM感染疾病的诊断和治疗问题急需解决。宏基因组测序方法避开了传统方法病原体培养、分离的局限性,直接分析样本中病原体,更好地解决目前结核和非结核鉴定困难、诊断时间周期长等问题。目前为止,基因测序是最精准的鉴定NTM菌种的方法,并且测序只需要极少的菌。 将宏基因组测序技术应用于临床检测NTM,对于临床医生将解决了一个棘手的问题,该方法辅助临床诊断以及对药物治疗提供了可靠依据,通过16sRNA测序检测高度保守的16s核糖体亚基,准确鉴定、分析样品中的病原体是否含有NTM,同时对测序病原体耐药性进行预测,通过与耐药相关基因进行比对,确定耐药基因是否发生基因突变来完成病原体对药物耐药性的预测。宏基因组测序技术应用于NTM检测及耐药分析,可较容易地在短时间内区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌,减少了误诊几率、诊断时间,并且根据药敏性分析更好地确定药物,避免了耐药性带来的错误用药问题。 参考文献: 1. 中华医学会结核病学分会.《非结核分枝杆菌病实验室诊断专家共识》.中华结核与呼吸杂志;2016,39(6):438-443. 2. Yon Ju Ryu,Won-Jung Koh,M,Charles L.Daley. Diagnosis and Treatment of Nontuberculous Mycobacterial Lung Disease:Clinicians’ Perspective.Tuberc Respir Dis;2016 Apr.79(2):74-84. 3. Kendall BA,Winthrop KL.Update on the epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacterial infections.Semin Respir Crit Care Med 2013;34:87-94. 4. Adjemian J,Prevots DR,Gallagher J,et al.Lack of adherence to evidence-based treatment guidelines for nontuberculous mycobacterial lung disease.Ann Am Thorac Soc 2014;11:9-16. 采用噬菌体介导的同源重组进行基因敲除; 阳性率95%以上; 已成功构建结核分枝杆菌4000余个基因的噬菌体文库和基因过表达质粒; 广泛适用于结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、海分枝杆菌。 另有pJV53介导的基因敲除。 纯度高:大于95%; 内毒素低:小于0.1EU/μg; 外源因子含量低; 成熟的蛋白质纯化平台; 可个性化定制; 大包装可免费分装。 测序基本参数 测序读长双端 150 bp(PE150), 过滤后单样本高质量数据量(>Q30)平均 900 Mb 以上,原始数据平均 1000 Mb 以上。 耐药分析 与国内权威单位合作建立了强大的数据库和云端分析平台,可结合NGS结果对测序菌株抗结核药物敏感性和耐药性进行全面预测分析。 菌株遗传距离分析 比较不同菌株间遗传距离,可用于鉴定结核病近期传播或暴发事件,为流行病学调查和结核病防控提供理论依据。 联系我们 上海晶诺生物科技有限公司 电话:0757-29328131-616 手机/微信:13392273325 Q Q:2775427010 业务:info@gene-optimal.com 招聘:hr@gene-optimal.com 地址:广东省佛山市佛山新城岭南大道2号中欧中心A栋(分公司) 官网:www.gene-optimal.com 晶诺生物 专业生物技术服务 |
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来自: 余元子 > 《NTM实验室检查》