【JEV】内皮细胞的microRNA过表达、外泌体释放、自噬诱导，影响肿瘤血管生成

抗血管生成治疗（AATs）是通过抑制肿瘤血管生成和破坏已有的肿瘤相关血管来抑制肿瘤生长，但其效果并不像最初预期的那么好。AATs的作用是短暂的，经过治疗的肿瘤通过不同形式的血管生成，包括内皮血管生成和血管生成拟态（VM）等，显示出更快复发。

最近有研究表明，MicroRNAs（miRNAs）可以调控与肿瘤发生和血管生成相关的基因表达。在HCC组织和肿瘤相关内皮细胞（ECs）中，致癌因子miR-9显著升高。据报道，miR-9可增加肿瘤细胞中血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进肺癌和结直肠癌的肿瘤血管生成和进展。此外，miR-9可以促进自噬，这是一种细胞通路，参与蛋白聚集物的清除、细胞器的翻转，以及自噬降解副产物的回收。然而，miR-9是否诱导血管生成以及miR-9诱导的血管生成是否受抗自噬治疗的影响尚未可知。

2019年6月17日，华西大学华西基础医学与法医学院的曾烨副研究员与纽约城市大学的Bingmei M. Fu在《Journal of extracellular vesicles》杂志上合作发表了最新重要工作[1]，他们发现了HCC血管生成和进展的增强是由ECs所释放的富含VEGF外泌体引起的，且ECs在抗血管生成和抗自噬处理中过表达了miR-9。

1、MiR-9能在体内诱导血管生成

为了模拟肿瘤相关ECs中miR-9的上调，我们将miR-9通过慢病毒形式转染到HUVECs中（图1a）。基于Matrigel栓中活性血管生成对血管生成因子的响应，研究人员将Matrigel栓与HUVECs混合进行实验，用于评估体内血管生成。血小板内皮细胞粘附分子1 （PECAM1，或CD31）是内皮细胞的标志物。人祖细胞分化抗原簇（CD34）也表达于HUVECs上，是血管生成的内皮细胞标志物。通过这些特定的EC标记物，我们找到了在Matrigel栓中形成的微血管，这些Matrigel栓与过表达miR-9的HUVECs混合，而没有添加其他血管生成因子（图1b，e，f）。实验结果表明，miR-9组与NC组相比，血管生成微血管的数量显着增加（图1c），且由miR-9诱导的新生血管直径比NC组大（图1b，e，f）。此外，CD31在新生血管中也高表达（图1e）。研究人员仅在过表达miR-9的HUVECs中观察到人CD31阳性ECs形成的血管，而在NC和miR-9组中均发现鼠CD31阳性EC形成血管样结构（无明显腔），表明miR-9应促进血管生成（图1e，f）。与NC相比，miR-9抑制细胞凋亡（图1g），增强Flk1磷酸化（图1h），提高自噬标志物LC3B水平（图1i）。

随后研究人员分析了miR-9在HUVECs中VEGF和Flk1表达中的作用。与血管生成诱导一致，miR-9增加HUVECs中VEGF和Flk1的mRNA和蛋白水平（图1j-l），并诱导VEGFA的释放（图3e），提示miR-9促进VEGF信号通路相关的自分泌作用，诱导血管生成。

图1 MiR-9诱导血管生成

2、MiR-9和抗血管生成的vandetanib诱导自噬

为了研究miR-9是否诱导自噬以及vandetanib抗VEGFR2（Flk1）治疗是否也诱导自噬，研究人员评估了在有和没有vandetanib处理的情况下过表达miR-9 HUVEC中自噬的变化（图2）。在miR-9转染HUVECs后，实验人员观察到大量形态完整的早期/初始自体自噬泡（AVis）和晚期/降解自体自噬泡（AVds），其中包含降解的细胞质材料和溶酶体融合成分（图2a，b）。Vandetanib处理显著增加了HUVECs的AVds, 并且miR-9进一步提高AVds的增加，而miR-9抑制AVis的增加（图2a，b）。无论是否过表达miR-9，Vandetanib处理能增加HUVECs中AVs的大小（图2c），同时也能诱导多泡体（MVBs）与液泡的融合（图2a）。在NC和miR-9组中，Vandetanib处理能诱导自噬蛋白LC3B和Beclin-1表达（图2 d，e，h，i）， LC3BI转化为LC3BII，p62的降低（图2h，i）和自噬泡的减少（图2g），表明Vandetanib处理可以诱导自噬及miR-9能增强自噬。研究人员还评估了自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA，5mM）对miR-9和vandetanib诱导的自噬的逆转作用（图2d-i）。使用3-MA能显著抑制miR-9和vandetanib诱导的自噬（图2e，h，i），包括抑制LC3B和Beclin-1的表达（图2d，e,，h，i)）、LC3BI向LC3BII的转化（图2h，i）以及p62的降低（图2h，i）。3-MA还减少了LC3B斑点（图2d-f）和自噬泡的数量（图2g）。

图2 Vandetanib促进miR-9诱导的自噬

3、Vandetanib和3-MA抑制血管生成

图3a表明使用vandetanib 60分钟后，miR-9诱导的Flk1表达和Flk1磷酸化显著受到浓度依赖式抑制（2uM时P <0.05；4和8uM时P <0.01）。研究人员还发现，使用4uM vandetanib或5mM 3-MA 60分钟几乎能完全抑制由miR-9诱导的Flk1磷酸化和消除其在细胞膜上的重定位（图3b，c）。虽然vandetanib没有改变HUVECs中VEGF mRNA的表达，但它降低了由miR-9增加引起的VEGF mRNA表达（图3d）。不同的是，3-MA降低了HUVECs中VEGF mRNA的表达，完全抑制了miR-9增加引起的VEGF mRNA表达（图3d）。相应地，3-MA和vandetanib也抑制了miR-9增加引起的VEGFA分泌（图3e）。相反地，vandetanib和3-MA在miR-9过表达和不过表达的情况下都没有显著改变HUVECs中miR-9的水平（图3f）。

实验人员发现，用vandetanib或3-MA处理EC，可以抑制由miR-9诱导的迁移和侵袭（图3g-i）。因此，无论是用vandetanib或3-MA处理，还是两者均处理，都显著降低了miR-9诱导的成管、管长和网络连接数（图3j-l）。这些结果表明，miR-9不仅通过激活Flk1信号传导，而且通过自噬促进HUVECs的血管生成。抗血管生成和/或抗自噬抑制了由miR-9诱导的血管生成（图3m）。

图3 自噬对Flk1依赖的血管生成起辅助作用

4、在使用vandetanib或3-MA后，HUVECs释放了VEGF富集的外泌体

图4a、b显示，miR-9虽然没有改变细胞外囊泡（EVs）的数量和大小分布，包括外泌体和微囊泡（MVs）但显著地将细胞间隙从147.0±29.9 nm （NC）扩大到716.1±44.8 nm（图4c）。令人惊奇的是，抑制血管生成的vandetanib处理（anti-VEGFR2）和3-MA（自噬抑制剂），不仅进一步扩大细胞间隙至896.2±94.3 nm和1284.0±357.2 nm（图4b），但也增加了EV的数量并改变了它们的尺寸分布（图4c）。

研究人员随后用HUVECs的细胞培养上清采取超离的方式分离外泌体，并用TSG101、HSP70和CD63作为蛋白标记的marker（图4d）。分离的外泌体直径大小范围多数在30-150nm（图4e），且外泌体呈茶托状结构（图4e）。使用纳米流式检测进一步检测了两组外泌体（exo1和exo2），这些外泌体从过表达miR-9的HUVECs细胞培养上清中富集了VEGF，且富集发生在添加了vandetanib或3-MA后（图 4g）。虽然vandetanib或3-MA增加了从HUVEC培养上清分离的外泌体中VEGF的表达量，伴随了miR-9的过表达进一步增加了VEGF富集（图4h-j），但是它们都不影响外泌体中miR-9的含量（图4i）。

外泌体中VEGF含量明显高于细胞培养上清和去外泌体培养基中的VEGF含量（图4k），说明VEGF大多来自于vandetanib 或 3-MA处理后HUVECs释放的外泌体中。

上述结果表明，使用VEGFR2或自噬抑制剂处理可促进ECs释放VEGF富集的外泌体，特别是那些与肿瘤相关的ECs（过表达miR-9）（图4l）。

图4 VEGFR抑制剂（Flk1）或自噬抑制剂能使HUVECs释放VEGF富集的外泌体

5、VEGF富集的外泌体能在体外促进HCC细胞的克隆形成和血管拟态

为了探索VEGF富集的外泌体对HCC发展的作用，研究人员分别在存在和不存在VEGF中和抗体Bevacizumab的情况下，用过表达miR-9的HUVECs及在vandetanib或3-MA处理下分离得到的外泌体作用恶性HCC细胞系Huh7和SMMC-7721。图5a-f显示，与在没有抑制剂处理的情况下从过表达miR-9的HUVECs中得到miR-9富集的外泌体相比，这些VEGF富集的外泌体能显著增加Huh7和SMMC-7721细胞的克隆和血管生成。hVEGF对克隆和血管形成的影响与VEGF富集的外泌体相似。Bevacizumab能显著减弱由这些VEGF富集的外泌体诱导的克隆和血管生成，表明VEGF是这些外泌体中的主要内容物，其应是vandetanib不能引起血管生成持续减缓的原因。

用GW4869抑制HUVECs的外泌体释放后，VEGF在细胞培养上清的含量明显降低（图5g），同时HCC细胞与过表达miR-9和用vandetanib或3-MA处理的HUVECs共培养后，其血管生成也被显著抑制，证明了释放富集VEGF的外泌体对血管生成产生了影响。

上述结果表明，VEGF富集的外泌体能提高HCC的增殖和癌细胞的血管拟态（VM）。

图5 VEGF富集的外泌体能诱导HCC细胞的克隆形成和血管生成拟态（VM）

6、VEGF富集的外泌体能在体内促进肿瘤血管生成和HCC进展

为了在体内验证VEGF富集的外泌体对HCC进展的作用，研究人员将与SMMC-7721细胞混合的Matrigel和从HUVECs分离到的外泌体皮下注射到无胸腺裸鼠的腹侧区域。实验结果显示，与注射了PBS和Matrigel混合物相比，注射了从HUVECs获得的外泌体和Matrigel混合物的小鼠肿瘤生长显著增加（图6a-c）。然而，在经过3-MA处理后，从过表达miR-9的HUVECs中分离到含有VEGF富集的外泌体，将外泌体与Matrigel混合物注射到小鼠体内会形成更大的肿瘤。

除此之外，研究人员通过CD34的免疫组织化学（IHC）染色（图6d）和PAS染色来定量肿瘤切片中的EC血管生成和VM。与PBS和对照组外泌体相比，从过表达miR-9的HUVECs（未经vandetanib或 3-MA处理）获得的外泌体（血管数目P < 0.001，血管直径P < 0.01）能够诱导更多内皮血管的形成，但不能诱导更多VM的形成。然而富含VEGF的外泌体不仅能诱导更多的内皮血管形成（图6d-f），而且还形成更多的VM（图6d-g），表明富含VEGF的外泌体能特异性地促进VM形成。

图6 VEGF富集的外泌体能诱导肿瘤发生和促进肿瘤血管生成

随后，研究人员验证了用miR-9和富含VEGF外泌体处理的肿瘤细胞中VEGF（图7a）、p-Flk1（图7b）和Flk1（图7c）的蛋白水平分别得到提高，这些增加通过WB被进一步确认（图7d，e）。用PBS、NC、miR-9和富含VEGF的外泌体处理了肿瘤细胞，在其中没有观察到凋亡的变化。

图7 富含VEGF的外泌体对VEGF水平和Flk1激活的影响

结论

文章中的实验结果表明，AATs和抗自噬处理后肿瘤血管生成和进展的变化是由于内皮细胞和肿瘤细胞通过VEGF富集的外泌体相互作用的结果。

参考文献：

[1] Zeng Y, et al. Anti-angiogenesis triggers exosomes release from endothelial cells to promote tumor vasculogenesis. J Extracell Vesicles. 2019 Jun 17;8(1).