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前言 小胶质细胞是高度可塑的免疫细胞，其存在于连续的激活状态中。通过塑造少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的功能，分化为髓鞘形成细胞的脑细胞，小胶质细胞在多发性硬化期间参与髓鞘损伤和髓鞘再生。然而，小胶质细胞在支持或抑制髓鞘修复中的作用方式仍然很不清楚。7月30日意大利IRCCS Humanita与CNR神经科学研究所团队在Acta Neuropathologica查看期刊详情上发表了“Detrimental and protective action of microglial extracellular vesicles on myelin lesions: astrocyte involvement in remyelination failure”，文章分析了由小鼠胼胝体中溶血卵磷脂注射引起的脱髓鞘损伤的促炎或促再生小胶质细胞在体外产生的细胞外囊泡（EV）对OPCs的影响。髓鞘蛋白的免疫标记和电子显微镜检查显示，促炎性小胶质细胞释放的EV阻断了髓鞘再生，而与免疫抑制间充质干细胞共培养的小胶质细胞产生的EV促进了OPC募集和髓鞘修复。在初级OPC培养物中解剖了导致有害和有益的EV作用的分子机制。通过将单独培养或与星形胶质细胞一起培养的OPC暴露于炎性EV，观察到仅在星形胶质细胞存在下阻断OPC成熟，暗示这些细胞再髓鞘衰竭。如免疫组织化学和qPCR分析所示，生化分级显示星形胶质细胞可被炎性EV货物转化为有害细胞，而EV的表面脂质组分促进OPC迁移和/或分化，将EV脂质与髓鞘修复联系起来。虽然脂质物质增强OPC成熟的机制仍有待完全确定，但首次证明了囊泡鞘氨醇1磷酸盐刺激OPC迁移，这是髓鞘修复的第一个基本步骤。从这项研究中，小胶质细胞EV作为多模式和多靶点信号传递介质出现，能够影响髓鞘病变周围的OPCs和星形胶质细胞，可用于开发新的髓鞘修复方法，不仅可用于多发性硬化，还可用于神经和神经精神疾病的特征。  研究思路  Figure 1：小胶质细胞浸润髓鞘病变释放EVs。CC的EM图像显示类似小胶质细胞（a），少突胶质细胞（b）和星形胶质细胞（b）的暗细胞，在10dpl渗入脱髓鞘病变。c显示了从暗小胶质细胞表面出芽的EV的示例。  Figure 2：具有不同活化状态的小胶质细胞释放的EV的产生和表征。a体外小胶质细胞极化方案。b炎症标志物（IL-1a，C1q，TNF-α，IL-1β和iNOS），前再生标志物和未受刺激的小胶质细胞，IL中代谢基因Chpt1的基因表达-4-处理的小胶质细胞或小胶质细胞在缺乏（i-MG）或存在MSC时用炎性细胞因子刺激。c 100kg颗粒中异种群小胶质细胞EV的代表性冷冻EM图像。d从小胶质细胞沉淀的EV大小轮廓，重悬于过滤的PBS中并使用NTA分析。e使用来自532nm激光线的平均拉曼光谱. f对拉曼光谱进行多元统计分析。  Figure 3:EVs对EVs早期响应的行动。a在OPC募集阶段向LPC处理的小鼠递送EV的实验设计。直方图显示总增殖细胞的密度（b）和BrdU+增殖OPCs百分比（c）。d盐水，i-EV，IL4-EV或MSC-EVs注射病灶的代表性图像. e对应密度的Sox10 +细胞 ;单因素ANOVA和未成熟少突胶质细胞的百分比. f-h生理盐水，i-EV，IL4-EV或MSC-EV的代表性图像s注射的病变针对MBP和DAPI（f）或针对NG2，Sox10和DAPI（h）进行免疫染色。g，i直方图显示对MBP免疫反应的损伤区域的百分比（g）或NG2（i）在盐水注射的小鼠和接受不同类型的EV的小鼠中。  Figure 4:EVs对急性LPC介导的局灶性脱髓鞘中髓鞘沉积的作用。a在OPC分化阶段向LPC处理的小鼠递送EV的实验方案。b直方图显示注射盐水的小鼠和接受i-EV或MSC-EV的小鼠中未成熟和分化细胞，少突胶质细胞的百分比。盐水，i-EV或MSC-EV注射病灶的代表性图像，针对MBP（c），NG2（e）或CC1（g）进行免疫染色。直方图显示对MBP免疫反应的损伤区域的百分比（d），NG2（f）或成熟少突胶质细胞密度（CC1）（h）. i注射盐水的小鼠和接受i-EV或MSC-EV的小鼠的CC的代表性电子显微照片. j显示无髓鞘/有髓纤维的百分比. K 髓鞘厚度可以通过G比定量，定义为内部和外部（d）有髓鞘轴突的直径。m显示髓鞘厚度。n G轴比率与轴突直径的散点图.  Figure 5:小胶质细胞衍生的EV对年轻小鼠髓鞘损伤的OPC分化的作用。盐水，i-EV和MSC-EVs注射病灶的代表性图像，针对MBP（a），NG2（c）或CC1（e）进行免疫染色。低倍率插入物显示DAPI的双重标记。直方图显示在注射盐水的小鼠和注射i-EV或MSC-EV的小鼠中7dpl处MBP（b），NG2（d）或CC1（f）免疫反应的损伤区域的百分比.  Figure 6:EV对OPC迁移，分化和髓鞘形成的影响。a，b用EdU孵育的培养的OPC的荧光图像，在暴露于i-EV或MSC-EV后固定并染色NG2和DAPI。b显示了暴露或不暴露于不同EV类型的培养物中EdU+OPCs的百分比。c显示在对照条件下和添加不同类型的EV后，通过Boyden室过滤器迁移的OPC的百分比。d存在或不存在S1P受体拮抗剂S-FTY720-乙烯基膦酸盐时，迁移的OPCs响应S1P或IL-4-EV的百分比。eOPCs的代表性图像保持在对照条件下或暴露于不同类型的EV，固定并染色为MBP，GPR17和DAPI。fMBP+OPCs的相应量化。g对照OPCs和IL4-EVs处理的OPCs的Western印迹，用于指示OPC分化的标志物。hOPC-DRG共培养物的代表性图像保持在对照条件下或暴露于i-EV，IL4-EV或MSC-EV，固定并染色为MBP和神经丝。i在不同实验条件下的髓鞘形成指数.  Figure 7:星形胶质细胞将i-EV的促分化作用转化为抑制活性。a在存在或不存在对MBP，Olig2和GFAP免疫染色的i-EV存在或不存在时单独培养或与星形胶质细胞一起培养的OPCs的代表性图像。b MBP+OPCs的相应量化。未刺激的星形胶质细胞中的A1（c）和A2（d）标记物表达，暴露于i-EV的星形胶质细胞，i-EV（脂质）的脂质部分，MSC-EV的代表性qPCR分析。右图显示在存在/不存在TNF-α抑制剂依那西普的情况下暴露于i-EV的星形胶质细胞中的A1和A2标记物表达。e盐水，i-EV或MSC-EV注射病灶的代表性图像，针对C3或PTX3和Hoechst进行免疫染色。f盐水，i-EVs-，i-EVs+ETN或MSC-EVs注射病灶中C3-和PTX3-阳性星形胶质细胞的密度。g在炎性小胶质细胞和MSC处理的小胶质细胞中的IL-1a，C1q和TNF-α的ELISA定量.  Figure 8:EV有效地与OPC交互。通过光学镊子向OPC递送EV的示意图。a相位对比图像的序列，在a中描述的过程之后驱动到OPC的EV的一个示例。b，c使OPCs保持在对照条件下或暴露于完整的EV，EV或EV的脂质提取物，固定并染色为MBP。图显示暴露于来自Brk IL4-EV或MSC处理细胞的破碎EV的培养物中成熟MBP+少突胶质细胞的百分比（b），从IL4-EVs提取的完整EV或天然脂质（c）。 结论 研究揭示了小胶质细胞在控制髓鞘再生中所产生的EV的先前未被认识的作用，这是OPCs分化成髓鞘形成细胞，恢复髓鞘以保护轴突免于退化并允许快速信号传递的自发过程。具体而言，文章显示来自差异条件性小胶质细胞的外源性EV对髓鞘再生具有相反的作用，具有促再生或有害作用，这取决于调理刺激的类型。重要的是，研究还揭示了星形胶质细胞在介导促炎小胶质细胞EV的有害作用方面前所未有的作用。最后，它首次鉴定了涉及星形胶质细胞有害转变以及促进OPC迁移和/或分化的EV的不同分子组分，从而揭示了调节髓鞘修复的新靶标。 EV介导少突胶质细胞的小胶质细胞作用 先前的证据表明，小胶质细胞表型强烈影响髓鞘再生，并且小胶质细胞的主要促再生反应是损伤后有效髓鞘修复所必需的。然而，小胶质细胞在促进或抑制髓鞘修复中的作用方式尚不清楚。在本研究中，通过利用组合方法明确地表明，再生小胶质细胞释放的EV促进LPC诱导的髓鞘病变中的OPC募集和分化，而来自炎性小胶质细胞的i-EV阻断髓鞘再生。研究通过显示（1）暗髓，反应性小胶质细胞被募集在髓鞘病变并释放EV，如EM所示，以及（2）EV足以介导对髓鞘形成细胞的有害或有益功能，从而推进了当前的知识，反映了供体小胶质细胞的表型，在外源性给予损伤部位。EV在注射部位短时间内保持完整，可能是溶酶体降解或细胞融合和货物稀释的结果，但导致病灶周围少突胶质细胞的长期调节。这与最近的一项研究一致，该研究表明，小胶质细胞EV被设计用于递送抗炎细胞因子IL-4，在多发性硬化的EAE模型中诱导持久的免疫调节。然而，对于OPCs具有相反作用的EV是否可能由小胶质细胞内源性产生并且可能与MS的动物模型中的脱髓鞘和再髓鞘形成过程相关仍然不清楚。需要用于操纵内源性EV产生的选择性工具来克服研究的这种局限性并分析小胶质细胞EV在更生理环境中的作用。 A1星形胶质细胞介导i-EV对OPCs的有害作用 本文的主要发现是星形胶质细胞介导炎性小胶质细胞衍生的EV对OPCs的有害作用。虽然i-EV本身有利于OPCs在单一培养中的分化，但当OPCs与星形胶质细胞共培养时，它们会导致OPC成熟的明显阻断，从而模拟体内LPC-脱髓鞘模型中i-EV对髓鞘损伤的抑制作用。重要的是，OPC/星形细胞共培养物中OPC成熟的抑制可能与星形胶质细胞转化为A1有害细胞相平行。事实上，之前的研究表明，当暴露于i-EV时，培养的星形胶质细胞会变得肥大并上调炎症标志物。通过分析本研究中少数特异性A1和A2标记物的表达和免疫反应性，文章认为星形胶质细胞在体外和LPC-小鼠髓鞘损伤模型中均获得有害的A1表型。最近，A1星形胶质细胞被证明可以减缓OPC分化并破坏分化的少突胶质细胞，并且已经在MS患者的脱髓鞘斑块中观察到。通过显示小胶质细胞i-EV引起A1星形胶质细胞转化，添加了一条重要信息，以了解可能导致MS髓鞘再生失败的机制.相比之下，到目前为止，在炎性小胶质细胞的分泌蛋白组中尚未鉴定出具有破坏OPCs /少突胶质细胞能力的分子，其中含有髓鞘形成细胞的保护剂。 EV信号驱动星形胶质细胞向寡毒细胞 虽然分析表明EV携带糖脂乳糖神经酰胺（LacCer）和S1P，EAE中促炎性星形胶质细胞激活的已知诱导剂，但i-EV的脂质提取物不会在培养的星形胶质细胞中产生有害转化，暗示i-EV的蛋白质和/或RNA货物在获得有害的星形胶质细胞功能中的作用。先前的研究报道，活化的小胶质细胞释放三种介质，这些介质对星形胶质细胞转化为有害细胞是必需和足够的，即TNF-α，IL-1a和C1q。在这里，文章显示（1）i-EV携带A1星形胶质细胞的三种诱导物，（2）MSC-EV中TNF-α减少，其不引起有害的星形胶质细胞转化，和（3）TNF-α失活部分抑制促炎性星形胶质细胞反应。除了将TNF-α鉴定为小胶质细胞中MSC作用的靶标外，该证据还表明星形胶质细胞向低毒性细胞转移囊泡TNF-α。然而，其他分子可以在MSC-EV中分选。 之前在MS患者的血清，脑脊液和脑斑中报道了TNF-α的升高，与疾病严重程度或恶化相关。此外，最近显示TNF-α主要由急性和进行性EAE中的小胶质细胞和巨噬细胞产生，增强临床残疾。MS患者的小胶质细胞EV中TNF-α含量是否升高，尤其是进展型MS患者，是未来研究中可能导致新型疾病生物标志物鉴定的重要问题。然而，在设计促进髓鞘修复的可能的治疗策略时，应注意TNF-α在MS中被认为是有害的和保护性的。具体而言，细胞因子的膜结合形式显示通过激活少突胶质细胞中的2型TNFR2来维持修复过程，从而阻止在MS中临床使用TNF-α阻滞剂。 脂质在EVs前髓鞘作用中的关键作用 研究的另一个重要观察结果是，所有类型的小胶质细胞EV的脂质含量对OPCs有直接影响，指导它们的募集和分化。 通过测量鞘脂含量和使用有效的S1P受体拮抗剂S-ene-FTY720乙烯基膦酸盐，显示S1P由小胶质细胞分泌，与EV结合，并作为OPCs的有吸引力的指导线索。虽然最近使用激活S1P受体的S1P类似物芬戈莫德/FTY720来治疗MS，但已经推动了S1P对少突胶质细胞直接作用的研究，数据首次证明了其作用的核心作用。OPC迁移中与EV相关的S1P，是髓鞘修复的第一个关键步骤。通过EV分馏，还显示所有EV类型的脂质促进OPC成熟，使脂质研究成为髓鞘修复领域的热点。排除了S1P参与EV的促分化作用，因为在S1P受体的药理学阻断下，EV加速OPC成熟的能力没有变化。文章预计，鉴定负责小胶质细胞EV的促分化作用的脂质可能有助于设计新的治疗方法以促进髓鞘修复。 以前的研究表明EVs的miRNA货物在髓鞘修复中，而不是脂质含量。先前在大鼠血清中鉴定了由外周免疫细胞衍生的前髓鞘外泌体.它们的促分化活性部分归因于将miR-219递送至OPCs。尽管miR-219存在于来自小胶质细胞的EV中，并且在i-EVs中被上调，但生化实验表明，不含核酸的EV的脂质部分保留了推动OPC成熟的能力，反对miRNA在小胶质细胞EV的直接促分化作用中的主要参与。然而，EV的RNA和/或蛋白质货物可通过影响病变周围的微环境间接调节OPC成熟。 来自与MSC共培养的小胶质细胞的EV的独特前髓鞘活性 文章表明MSC-EV具有独特的能力来刺激OPCs在髓鞘病变处的内源性修复反应。MSC-EV的促髓鞘作用超过IL4-EV在体外和体内的作用。这表明MSCs在EAE中的众所周知的作用至少部分地依赖于MSC在小胶质细胞表型上的旁分泌作用以及在髓鞘再生期间小胶质细胞与OPC和星形胶质细胞的通讯。还需要做进一步的工作来确定驱动有效髓鞘再生所需的MSC-EV的最小组成部分。选择的MSC-EV的腔组分与促分化脂质组合可以组装在低复杂度和脱靶效应机会低的EV模拟物中，这可能是慢性MS的新型治疗方法开发的理想工具。 全文链接: https://pan.baidu.com/s/1FwSr8PswbOxCQAzLlZPlNQ 提取码: y9pt EVs-Exosomes由苏大，浙大, 法国居里研究所数位博士、博后及教授创建。 |
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