2019年6月26日，国际学术期刊The EMBO Journal在线发表了题为Proteomic identification of a marker signature for MAPKi resistance in melanoma 的研究论文。瑞士苏黎世大学Mitchell P Levesque研究组通过对MAPKi敏感和抵抗的原发性黑色素瘤细胞进高通量亚细胞蛋白质组及RNA-Seq分析，深入分析了黑色素瘤中MAPKi耐药表型的转换及黑色素瘤耐药机制，鉴定了黑色素瘤对MAPKi抵抗的生物标志物。
BRAF抑制剂（BRAFi）是一种常见的治疗BRAFV600E突变的转移性或不可手术性黑色素瘤的药物。尽管BRAFi在50%的患者中达到临床反应，但获得性耐药性也频繁出现。通过对BRAFi抵抗机制进行深入的研究，发现MEK再活化是一个关键节点，BRAFi和MEKi联合疗法的发展改善了治疗反应，降低了毒性，延长了无进展生存期（PFS）和总生存期。然而，BRAFI/MEKI组合疗法也出现了获得性抵抗现象，并证明是由一系列基因畸变引起的。
研究者课题组之前的研究表明，获得性BRAFi抵抗与分化能力的丧失，溶酶体成分的表达，转移能力和上皮-间充质转化的潜能增加相关。间充质样黑色素瘤细胞对BRAFi治疗表现出耐药性，并且其谱系特异性基因表达下调，参与抗药性基因表达上调。增殖性黑色素瘤细胞TGFβ慢性接触也会导致表型转化，其中包括PI3K信号通路的激活，E-钙粘蛋白下调和组织特异性标记基因表达的缺失，并导致黑色素瘤异质性。关于黑色素瘤中的MAPKi耐药表型转换及黑色素瘤耐药的细胞机制的蛋白质组学研究还非常少。
研究者通过对MAPKi抵抗的黑色素瘤细胞进行蛋白质组学特征鉴定，探索在这一特征中发挥的作用的基因和蛋白，分析MAPKi治疗前患者活检组织有用的特征信息。通过应用高通量技术和RNA-seq分析，作者鉴定了与间充质表型相关的两种蛋白PTRF和IGFBP7，并证明PTRF与黑色素瘤侵袭性及MAPKi抵抗有关，患者组织活检进一步验证发现，PTRF在靶向治疗无反应的患者中表达量显著增高，而血清分泌蛋白IGFBP7可作为MAPKi抵抗的生物标志物。
1. 患者来源的抗BRAFi黑色素瘤短期培养表现出EMT表型两个转移性的对BRAFI LGX818（Encorfenib）和PLX4032（Vemurafenib）敏感的原发性黑色素瘤细胞（S1, S2）和4种BRAFi抵抗的短期培养的原代细胞（R1，R2，R3，R4）用于特征分析（图1）和蛋白质组学分析（样本策略）。R2和R3对于BRAFi具有内在抵抗，而R1和R4对药物为获得性抵抗。通过电子显微镜检查细胞形态，发现敏感细胞通常较小，并呈球形结构，而抗性细胞更大更平，具有成纤维细胞样形态。并且发现抵抗细胞具有更强的细胞粘附性，其基质金属蛋白酶2活性及N-cadherin表达水平更高。图1. 体内来源的黑色素瘤培养细胞对BRAFi治疗抵抗并具有EMT表型2. 对BRAFi和MAPKi抵抗进行KEGG通路分析研究者首先分离了上述两个敏感细胞和四个耐药细胞的亚细胞组分，并对其进行亚细胞蛋白质组学分析（组学策略）。在细胞质中检测4052个蛋白，上清液中检测1007个蛋白，核中检测3463个蛋白，并对其分别分析获得耐药特征（第一个蛋白质组队列）。接下来，作者使用7个敏感和13个抗药性细胞组成的更多队列在第二个MS中心进行验证（第二个蛋白质组队列）。KEGG通路分析结果显示两个蛋白质组队列具有高度可比性，以第一个蛋白组队列中细胞质的KEGG通路部分（图2A和C）和第二蛋白质组队列（图2B和D）中分别以“细胞粘附分子”（图2A和B )和“ECM受体相互作用”（图2C和D）途径为例，几乎每种蛋白质都出现上调（红色）。3. 15种蛋白质对敏感细胞和抵抗细胞具有最高的识别能力作者对蛋白质组学鉴定到5478种蛋白质进行了层次聚类和最近邻质心分类分析，其中，细胞质部分13种蛋白质（ALDH1A1，PRDX2，PTRF，PDLIM1，IGFBP7，OxCT1，FAM129A、SERPINB6、ALDH133、DDX12P、KYNU、UCHL1和CES4a）可区分药物敏感和耐药黑色素瘤细胞（图3A）。分泌体中五种蛋白质（IGFBP7、PCOLCE、NAMPT、NID1和THBS2）可区分敏感细胞和抵抗细胞的：（图3B）。最引人注目的是，两种蛋白质（IGFBP7和PTRF）可作为区分药物敏感和耐药细胞的细胞核部分（图3C）。 通过与RNA-Seq数据（6个敏感和10个耐药细胞系）进行比较，进一步验证了蛋白质组耐药特征分析结果 (图3E-F)。
图3. 蛋白质组学数据的聚类分析4. PTRF和IGFBP7蛋白表达BRAFi治疗的重要的Biomarker为了评估PTRF的表达与临床相关性，作者对BRAFI治疗前后3个月、6个月和9个月以上无进展生存期患者的黑色素瘤活检组织进行染色，PFS最低的患者队列对应最高的PTRF的表达量（图4A-C）。与中、高PFS患者相比，低PFS患者PRTRF表达有显著差异（图4D）。Ikaplan–Meier曲线表明，PTRF与PFS和TTD（死亡时间）两个临床参数显著相关（图4E）。因为IGFBP7是一种分泌蛋白，作者对MAPKi治疗19例受试者血清标本进行ELISA检测，在复发患者血清中IGFBP7水平更高（图4F）。图4. PTR和IGFBP7与药物活性及临床相关性分析综上所述，本研究通过对MAPKi敏感和抵抗的原发性黑色素瘤细胞进行高通量蛋白质组及RNA-Seq分析，最终筛到足以区分这些表型15种蛋白质，其中在间充质耐药细胞中高度上调的两种蛋白PTRF及IGFBP7具有最高识别力。进一步研究发现PTRF与黑色素瘤侵袭性及MAPKi抵抗有关，患者组织活检进一步验证PTRF表达水平是无进展生存率低的重要生物标志物，而血清分泌蛋白IGFBP7可作为MAPKi抵抗的生物标志物。本研究揭示了黑色素瘤细胞间充质表型转变及治疗抵抗的分子机制。
