告别ChIP-Seq的折磨：CUT&Tag技术详解

编者按：新的方法、新技术的革命往往给科学研究带来天翻地覆的变化。近期出现的CUT&Tag将繁复的ChIP-Seq变成便捷简单的操作，为研究DNA-蛋白质相互作用提供了有效的工具。

前不久，弗雷德哈钦森癌症研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公开了CUT&Tag技术的详细结果与实验方案。与以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比，CUT&Tag技术方法简便易行，信噪比高，重复性好，需要的细胞数量少至60个细胞，且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平，再一次展现了创新技术方法的潜力。早在2018年5月，中国本土公司近岸蛋白质（NOVOPROTEIN）便公开了该方法替代ChIP-Seq的可能性与核心原料ChiTagTM酶（一种Protein A与Tn5融合蛋白）的技术原理（图1），表明中国生物技术公司已经走出对国外公司的简单模仿，在某些领域的自主创新能力走在了世界的前列。Henikoff博士的文章进一步展示了ChiTag (Chromatin Immuno-Tagment)酶在解决蛋白质-DNA相互作用的巨大潜力。

图1. CUT&Tag 原理示意图。

CUT&Tag是什么，它将带来哪些影响？

CUT&Tag是蛋白质-DNA互作关系研究的新方法，相较于传统的ChIP-Seq具有以下优点：省时高效，所需的细胞量少，背景信号低，可重复性好等优点，甚至可用于单细胞水平测序。CUT&Tag有望将蛋白与染色质DNA互相作用的研究变成了一种类似PCR反应的常规操作，对基因调控、表观遗传等领域的研究具有革命性的意义。

在生物学研究中，DNA与蛋白质之间的相互作用（DNA-Protein Interaction, DPI）是至关重要的，基因的表达、调控、复制、重组和修复，RNA的转运、翻译和调控，都离不开DPI，几乎所有的生命活动都会涉及DPI。早在十九世纪后期，科学家就通过显微镜观察到了蛋白质与DNA直接的相互作用，从那以后，他们开始深入探索蛋白质结合并控制DNA的作用机制。为了研究DPI，科学家发明了很多方法：凝胶阻滞、DNaseI足迹实验、甲基化干扰、体内足迹、酵母单杂、ChIP-Seq等。其中，ChIP-Seq由于能真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白，是目前全基因组水平研究DPI的标准实验技术。

ChIP-Seq的基本过程包括：通过甲醛交联将细胞内与DNA结合的蛋白固定，再裂解细胞，超声断裂DNA；将DNA-蛋白质复合物结合在特异性抗体上，利用可以结合抗体的ProteinA磁珠将抗体-蛋白-DNA复合物抓取下来，之后将DNA与蛋白解离；将DNA片段补平，加A，加接头，最后进行高通量测序。由于ChIP-Seq实验过程中的甲醛交联、染色质片段化、免疫共沉淀以及文库构建等步骤繁琐且条件难以控制，常规ChIP-Seq实验需要大量细胞，且实验重复性差、信噪比低。往往辛苦培养了很久的细胞，挥霍一空后得到大量难以分析的数据，再次实验又得到一堆不同的无意义数据，甚至一个技术熟练的博士消耗大半年的时间毫无进展。这些技术上的困难限制了ChIP-Seq在DPI研究中的进一步应用，阻碍了表观基因组等领域的发展。

CUT&Tag技术的基本原理为：在抗体引导下，ChiTag酶仅在目的组蛋白修饰标志、转录因子或染色质调控蛋白结合染色质的局部进行目的DNA的片段化，同时添加测序接头，并释放到细胞外。由于绝大部分无关的染色质还留在细胞核内，因此整个实验的信噪比大幅提高，同时简化了实验步骤。该方法可一管式高通量应用，并可与单细胞测序平台“无缝”结合。ChiTag酶在打断基因组的同时加上接头，不需要繁琐的补平加A加接头，在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程。

CUT&Tag与ChIP-Seq流程比较：

图2. CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq实验结果对比：CUT&Tag具有更好的信噪比和更低的背景。（见文献）

图3. 左图：CUT&Tag、CUT&RUN、ChIP-Seq三种方法分析H3K4me1组蛋白修饰：CUT&Tag在识别染色质特征时最有效，能够给出ChIP-Seq无法读出的信息；右图： peak-Calling的对比，使用默认参数调用每种方法上的峰值，结果显示CUT&Tag比CUT&RUN、ChIP-seq或ATAC-seq有更高的信号。（见文献）

更重要的是，CUT&Tag能够对极少量细胞（60个细胞）甚至单细胞进行分析。由于PCR之前的反应都在细胞内进行，Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔，再加入带随机标签的引物进行扩增的办法，实现单细胞测序（图4）。

图4. CUT&Tag 单细胞测序流程（见文献）

附：CUT&Tag 实验操作流程

ConA磁珠沉淀细胞可用低速离心代替。低速离心指600 × g离心3min，快速离心指<100 × g离心3s。

1. 细胞预处理（0.5-1h） 

1) 室温下收集新鲜细胞置于EP管中并计数；低速离心，去溶液；

2) 管中加入细胞穿孔缓冲液重悬细胞；低速离心，去溶液；

3）管中加入细胞穿孔缓冲液再重悬细胞，轻柔震荡并滴加Binding 缓冲液重悬的ConA磁珠，轻柔颠倒混匀5-10min；

2. 一抗结合目的蛋白（2h）

1) 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架上沉淀细胞，去溶液。

2) EP管中加入预冷的抗体缓冲液将细胞重悬，轻柔震荡后置于冰上;

3) 每管中加入0.5-1μl一抗（抗体使用生产商推荐浓度），轻柔震荡；

4) 室温下将EP管置于摇床上孵育2h；

3. 二抗结合一抗（1h）

1) 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。

2) 将二抗1:100稀释于穿孔缓冲液，加入管中，轻柔震荡；

3) 室温下将EP管置于摇床上孵育30-60min；

4) 快速离心细胞，将管盖液体离心下来，EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。

5) 管中加入0.8-1ml 穿孔缓冲液，上下颠倒10次；

6) 重复步骤4)、5) 两次。

4. ChiTag转座体结合抗体（1.5h）

1) 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。

2) 将ChiTag转座体1:250稀释于穿孔缓冲液2中，并滴加于细胞上，轻柔震荡；

3) 室温下将EP管置于摇床上孵育1h；

4) 快速离心细胞，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。

5) 管中加入0.8-1ml穿孔缓冲液2，上下颠倒10次；

6) 重复步骤4)、5) 两次。

5. 激活ChiTag转座体，片段化目的DNA（1h）

1) 快速离心EP管，将管盖液体离心下来，将EP管静置于磁力架沉淀细胞，去溶液。

2) 管中加入300μl ChiTag激活缓冲液，轻柔震荡；

3) 37ºC孵育1h。

6. DNA提取（1h）

7. PCR（1h），PCR之前需加入72ºC，5min步骤

8. DNA纯化（30min）

9. 上机测序 

关于近岸蛋白质

近岸蛋白质（NOVOPROTEIN）成立于2009年，是一家专注于蛋白质技术创新与应用的高新技术企业。主要研究人员来自杜克大学、康奈尔大学、德州大学、复旦大学、华中科技大学等知名学府。公司拥有重组蛋白质、大容量抗体库、结晶结构、分子进化等创新技术平台。累计开发了13000多种重组蛋白质，其中包括560种药物靶点蛋白、50余种NGS与分子诊断用酶、200余种诊断抗体抗原、2000余种类器官与细胞培养因子等科研试剂。为国内外三百多家抗体药物公司与数千家科研机构及诊断试剂公司提供高品质蛋白质支持，产品被上千篇SCI论文引用。 

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