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程序性死亡配体和程序性死亡受体（PD-L1和PD-1）抑制剂是一种广泛有效的抑制剂，但是我们观察到在PD-L1高表达或TMB高的患者中疗效更好。免疫检测点抑制剂用于一线非小细胞肺癌患者单药治疗需要检测PD-L1。但是，疾病晚期患者获得足够的肿瘤组织存在较大的挑战。因此，需要一种诊断方法不依赖于足够的组织就能够预测患者是否可以从免疫治疗中获益。在此，我们描述了一种新颖和可靠方法用于确认血浆中的TMB（bTMB），该方法和组织为基础的方法不同。对两个大型的随机研究进行回顾性分析，通过验证我们发现bTMB可确认二线或二线以后的患者是否可以从阿特珠单抗治疗中获得PFS的延长。总体而言，研究数据显示bTMB在阿特珠单抗治疗非小细胞肺癌上是一种非常有价值的生物标志物。  介绍 针对PD-1和PD-L1免疫检查点抑制剂已被证实可以使晚期非小细胞肺癌患者获得显著的生存获益。在先前经过治疗的晚期非小细胞肺癌患者（二线或二线以上）中，阿特珠单抗和纳武利尤单抗可使得这些患者无需经过筛选就能获得显著的OS获益。例如，随机3期OA试验表明使用阿特珠单抗组的中位OS是13.8月，而使用多西他赛组的中位OS是9.6月。虽然PD-L1阳性患者中能够获得更长的OS获益，但是单纯的PD-L1表达还是不能完全解释患者经过药物治疗所带来的OS获益。即便如此，在一线治疗中，PD-L1表达检测仍然成为众多生物标志物中的首选。然而，获得足够的组织用于EGFR，ALK和TMB检测日益受到限制。此外，高达30%的非小细胞肺癌患者没有足够的组织用于标准的生物标志物检测。因此，开发一种无创的诊断方法鉴别PD-L1和PD-1单药治疗获益的非小细胞肺癌患者愈发重要。 最近研究显示，TMB可用于衡量整体肿瘤抗原负载。通过全外显子测序获得TMB和多个免疫检查点抑制剂的临床获益有密切联系。对CheckMate-026试验进行探索性分析，结果显示tTMB水平越高，纳武尤利单抗临床疗效越显著。此外，与全外显子测序比较，靶向测序也可以准确测量tTMB，且能够在晚期非小细胞肺癌患者、转移性黑色素瘤和转移性尿路上皮癌患者中筛选出抗PD-L1和PD-1治疗获益群体。 利用血液样本进行肿瘤基因组分析相对于组织标本更具显著优势。血液是稳定、同质的诊断标本，较难被单位点组织活检带来的样本偏好性影响。因此，以血液为基础的DNA检测受到越来越多的关注，而且许多方法可用于cfDNA突变检测，包括等位基因特异性PCR，数字PCR和NGS。此外，美国FDA最近批准第一个血液检测试剂盒用于EGFR基因突变检测。目前为止，大多数血液为基础的生物标志物检测方法均以PCR为基础。但是，最近研究显示NGS也是一个可行的方法。由于测序费用原因，大多数panel只能涵盖有限的基因组信息，并且未经临床证实。虽然血液用于TMB分析是可行的，但还未有一种可靠的、已验证的方法用于分析cfDNA中的TMB。 本研究开发并验证一种新的方法用于血液TMB检测。对两个前瞻性的随机试验中1000多例血浆标本进行检测，这些标本来自于二线或二线以后的晚期非小细胞肺癌患者。基于POPLAR试验样本，我们确定一系列和临床疗效相关的bTMB cut-point，并在随后OKA研究中得到验证。 结论 tTMB和bTMB具有相关性 bTMB试验使用杂交捕获方法，靶向1.1Mb的基因组编码序列。该方法同FDA批准的Foundation One CDx NGS方法是一样的。图Fig.1a描绘的是bTMB方法的示意图。 Fig.1a, A schematic depicting the development of the bTMB assay 为评估bTMB方法检测临床样本的性能，我们对比tTMB的检测结果。这些组织样本来自于POPLAR和OAK研究，相应bTMB结果来自对同一患者在治疗前的血浆。如Fig.1b所示，tTMB和bTMB之间存在正相关（斯皮尔曼等级相关=0.64，95%的置信区间为0.56-0.71）。tTMB和bTMB之间缺少高度相关性的原因包括，首先，二者在计算流程上存在根本的差别。其次，NSCLC的肿瘤异质性很大，单次活检获得的突变图谱和转移性肿瘤释放进入血液的ctDNA结果差异很大。最后，样本的自身特点也存在很大的不同，例如DNA来源、收集时间、样本类型、确诊分期、组织纯净度、ctDNA等位基因突变频率最大值和cfDNA投入量，这些都将导致最终TMB结果的差异。  Fig.1b, Pairwise comparison of tTMB and bTMB in patients from the POPLAR and OAK studies with adequate data from both platforms (N = 259 patient samples). 由于tTMB计算会纳入插入突变和SNVs，而bTMB计算只纳入SNVs，因此我们对比了二者在SNVs上的相关性。有趣的是，这个相关性没有改变太多，这也许是因为在这个研究中插入突变只占大约4%的体细胞突变。 为确认bTMB和tTMB之间的不同是否是由于试验中技术差异所带来的，我们使用一组单独的ctDNA样本来进行一致性分析，每个标本都经过tTMB和bTMB分析。如Fig.1c，在这次分析中，一致性为0.93，这显著高于试验中组织来源的DNA和血浆来源的ctDNA之间的一致性。这些数据表明，方法学并不是造成bTMB和tTMB一致性不高的主要原因。  Fig.1c, A comparison of TMB (the number of mutations) calculated using the F1 assay versus the bTMB assay from split ctDNA samples (N = 69 cell lines). 为了确保bTMB分析产生的变体调用是可靠的，我们垂直验证bTMB分析产生的变体调用。对于此分析，我们将临床样本和细胞系结合，对比bTMB分析检测的重叠区域的变体调用和FACT分析。PPA是通过计算同时由FACT和bTMB检测到的体细胞突变所得到的值。该PPA为93.4%。我们计算PPV。如Fig.1d所示，PPV为93.5%。对于PPA和PPV，不一致的变体调用是由于低丰度或相邻核苷酸寡聚物产生的。如Fig.1e所示。为了进一步评估试验的一致性，我们对比了配对突变体的等位基因突变频率（VAF），得到的VAF是高度一致的(R2 = 0.998)。但是，如Fig.1e所示，在VAF低于1%的时候，一致性较低(R2 = 0.6783)。这些数据表明两种分析方法检测的突变基本是一致的。  d, The PPA represents the fraction of the somatic variants from the FACT assay that was also detected in the bTMB assay.  Fig.1e, The VAF for matching variants detected in the overlapping regions for FACT and bTMB. NSCLC具有很强的肿瘤异质性。因此，患者任何单次的、局部的活检所得到的突变结果可能和肿瘤细胞释放到血液中的突变结果不一致。为了确定是否这样的异质性可能导致这些血液和组织样本TMB数值上的不同，我们评估了每个配对血液和组织的突变信息。如Fig.1f和Fig.1g所示，在那些血液和组织的TMB都高（> 30 mutations）的患者中，通常血液样本中有1/3个体突变是独特的，而组织样本中有1/4个体突变是独特的。组织样本中突变大于30种的患者，他们的bTMB和tTMB具有一致性。在22个患者中，有7个患者在血液中检测到很少的突变，因此和组织检测结果存在较大不同。相比之下，剩余68%的组织和血液样本中TMB突变情况大致上是一致。这个结果显示血液和组织样本中不同的突变类型可能很大程度上导致tTMB和bTMB的不同。  Fig.1f, A comparison of the TMB count between tissue and blood samples is shown for patients with a high (> 30) total mutation count derived from tissue.  Fig.1g, A Venn diagram showing the overlapping (59%) and mutually exclusive (25% tissue only; 26% blood only) variants shown individually in f. Cut-point确定 作为bTMB分析验证的一部分，我们使用正交验证法对bTMB准确性进行评估，该方法先前已证实和全基因组测序所得到TMB有很好的相关性。通过配对分析，我们对一系列可能cut-point（bTMB≥ 10 到 ≥ 20）的PPA和NPA进行评估。如Fig.1c所示，不同cut-point的PPA在85.7%（bTMB of ≥ 15）到100%（bTMB of ≥ 10）之间变动，NPA在81.8%(bTMB of ≥ 19)到100%(bTMB of ≥ 10 and ≥ 16）之间变动。这些结果显示分析体系可以在3个cut-point上进行选择优化，即bTMB of≥ 10, ≥ 16 and ≥ 20。我们选择这些bTMB cut-point作为基础评估POPLAR研究 POPLAR数据证实bTMB可作为标志物预测临床疗效 为评估临床疗效和bTMB评分之间的相关性，我们评估POPLAR研究中287位有意向治疗（ITT）患者基线时血浆样本（N=273）。由于样本体积未达标准以及MASF较低，仅211标本覆盖深度达到最低要求800×。如Fig.2所示，在POPLAR研究中，我们观察到ITT人群（N=273）和BEP人群（生物标志物可评估人群，N=211）的临床获益基本保持一致 (PFS方面， ITT HR: 0.92 vs BEP HR:0.90；OS方面，ITT HR: 0.69 vs BEP HR: 0.68)。  Fig. 2 | Forest plots of HRs for PFS and OS in the POPLAR study. 相对于POPLAR研究中的ITT人群和BEP人群，我们观察到3个bTMB cut-point (≥ 10, ≥ 16 and ≥ 20)均有效提高PFS和OS获益。在bTMB cut-point≥ 16时，PFS的HR为57%。阿特珠单抗组中位PFS是4.2月，多西他赛组中位PFS是2.9月；中位OS值分别是13.0月和7.4月。基于bTMB cut-point≥ 16在bTMB分析中的性能指标和较强PFS预测结果（对比bTMB ≥ 10 or ≥ 20），bTMB cut-point≥ 16被选择为cut-point用于OAK研究的验证分析。 OAK数据证实bTMB可作为潜在的无创的生物标志物用于PD-L1免疫治疗 在POPLAR研究中，我们证实bTMB可作为有效的生物标志物。在OAK试验中，我们对血液标本进行bTMB分析。797位临床入组患者基线时的血浆样本被用于分析；对583位（BEP）无EGFR或ALK突变患者进行cfDNA用于分析，最小覆盖深度800×。在OAK研究中，ITT人群（N=850）和BEP人群（N=583）患者特征基本一致，如Fig.3c和Fig.3f所示。总体而言，在OAK研究中，BEP人群的治疗疗效(PFS HR: 0.87; OS HR: 0.64)要优于ITT人群(PFS HR: 0.95; OS HR: 0.73)，这和POPLAR研究结果有些不同。 在bTMB≥ 16的亚组患者中（Fig3a-c），阿特珠单抗治疗组相较于多西他赛组的PFS有显著的获益（P = 0.013）。在bTMB≥ 16的亚组患者中（Fig3d-f），阿特珠单抗治疗组的中位OS为13.5月，多西他赛组为6.8月。  Fig. 3 | Association of clinical outcome and bTMB in the OAK study 使用多变量适应性回归曲线分析，建立起PFS HRs和cut-point值之间的模型。通过对OAK研究数据进行分析（Fig.3g），我们发现在12-18（bTMB值）之间出现弯曲，这个结果和POPLAR数据分析得到的cut-point（bTMB≥16）是一致的。 对OAK研究中不同的bTMB cut-point进行额外的探索性分析。整体而言，随着bTMB的升高，PFS也相应提高（Fig4a-b）。相似的，OS的情况也是如此。与PFS不同，bTMB升高到一定值时，OS HR会出现降低，而在高值时又升高（bTMB ≥ 24 and bTMB ≥ 26）。  Fig. 4 | Forest plots showing the association between the clinical benefit of atezolizumab and bTMB in the OAK study bTMB同临床特征以及PD-L1免疫组化的关联性 在OAK研究的BEP人群中，bTMB(≥ 16)状态和吸烟状态（P = 1.3 × 10–10），靶病灶基线时最长径之和(P = 4.8 × 10–8)，转移灶数量(P = 0.0055)和PD-L1表达(P = 0.0062)密切。 OAK研究中发现在所有ITT人群和PD-L1亚组中，阿特珠单抗相较于多西他赛可显著提高OS。相反地，仅在肿瘤高表达PD-L1（TC3或IC3）人群中，患者PFS获益更明显。为确定bTMB≥ 16人群的临床获益可能为PD-L1高表达人群，我们对比bTMB和PD-L1免疫组化亚组是否存在重叠。我们发现bTMB和PD-L1亚组各个比例构成基本一致（Fig.5a）。229患者为bTMB≥ 16或PD-L1高表达（TC3 or IC3），而仅有30名患者既是bTMB≥ 16又是PD-L1高表达的患者（Fig.5b）。这个结果表明bTMB和PD-L1表达之间是相互独立的。  Fig. 5 | Comparison of PD-L1 expression and bTMB counts in the OAK study 讨论 本研究证实血液TMB可作为生物标志物预测NSCLC患者对于阿特珠单抗的临床获益。这是首次证实血液能够准确、可重复测量TMB，同时发现bTMB和免疫检查点抑制剂的临床获益存在相关性。利用POPLAR和OAK样本验证NSCLC中bTMB≥ 16是有意义和稳定的cut-point。随后，进一步证明bTMB与PD-L1高表达没有相关性，作为PFS获益的独立预测因子。血浆替代组织使得bTMB分析更具有吸引力，尤其是针对无法活检的转移性非小细胞肺癌患者或者肿瘤组织不足的患者。 研究人员对bTMB的各项分析性能进行评估，使用POPLAR和OAK研究的组织和血液样本进行tTMB和bTMB的一致性分析，结果证实tTMB和bTMB是正相关的。但是，研究只针对配对标本进行评估，没有对不同时期的组织和血液标本进行突变分析评估。通过对技术和生物学参数的分析，发现配对标本bTMB和tTMB产生差异的主要原因是标本自身，而与计算以及分析方法等无关。此外，研究人员发现同样ctDNA样本经过bTMB和tTMB分析具有很高的一致性，且血浆中肿瘤来源的DNA比例过低以及间隔时间过长都会使得结果出现不一致。需要注意，POPLAR和OAK研究是二线以及二线以后治疗的研究，多数组织标本可能是患者一线治疗进展后3个月之内收集入组的，而3个月之外收集的样本主要是在一线化疗开始前就已经收集。这样，由于存在肿瘤异质性以及克隆选择性的缘故，像化疗引发DNA损失有可能会导致bTMB和tTMB的不一致。 PD-L1以及PD-1抑制剂一线治疗优势生物标志物的筛选是治疗策略的关键环节。POPLAR研究和OAK试验中无法证实OS获益可能是由于OAK BEP人群中的OS获益更优于ITT人群。但是，在一项前瞻性、一线NSCLC研究中，OS将成为次级终点，该研究探索bTMB阳性患者中阿特珠单抗对比一线标准化疗的疗效。 本研究表明使用联合生物标志物较单个生物标志物用于疗效预测可能更具优势。在高PD-L1表达（TC3 or IC3）和bTMB≥ 16的患者群体中，PFS获益更加明显。研究证实bTMB和PD-L1之间互不关联，且各自都可以筛选出阿特珠单抗治疗PFS获益的患者群体，且可能使得二线患者的OS同样获益。对于30%无法获得组织用于分子检测的NSCLC患者，使用血液进行基因分析具有非常明显的优势。但是，POPLAR和OAK研究中都强制要求使用组织，这可能对ctDNA的检测会有影响。 bTMB分析的局限性在于它需要血液中存在一定量的ctDNA进行分析，这意味着肿瘤必须将DNA释放进血液中，并且ctDNA上的突变丰度≥1%被认定为有效的突变。此外，ctDNA的检测也可能依赖于肿瘤负荷。在OAK研究标本中，MSAF< 1%亚组较于MSAF> 1%亚组的靶病灶基线时最长径之和要小（62.3 mm vs 80.4 mm）。bTMB额外局限在于后期计算主要依赖SNVs，在这个研究中可能不会影响bTMB和tTMB的一致性，但是，这个研究也会错失部分肿瘤存在大片段插入而SNVs相对少的患者。未来分析应将把插入突变纳入到bTMB分析算法处理。 总之，本研究表明血液TMB检测是可行的，且在cut-point≥ 16时能够筛选出阿特珠单抗治疗PFS获益的患者群体。为更好了解bTMB，及它与NSCLC相关的临床特征，仍有诸多工作需要进行。本研究已经证实将bTMB分析应用到一线治疗进展后的NSCLC患者诊疗流程是可行的。bTMB分析在一线NSCLC治疗的前瞻性，随机三期临床研究也在进行。 参考文献： David R. Gandara, et al. Blood-based tumor mutational burden as a predictor of clinical benefit in non-small-cell lung cancer patients treated with atezolizumab. Nature medicine. 2018. |
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