|
基因编辑 基因编辑，即通过对基因定点修饰以改变它的功能，并随之改变细胞乃至生物体的表型的一种生物学技术。无数科学家和不断改进的基因组编辑工具，一方面是更好地理解生命活动的规律和现象，另一方面可为靶向性改造生物提供更有效的手段，如基因治疗和遗传育种。 基因编辑的最早形式是基于同源重组的基因靶向技术，这只适用于一小部分模型系统，如小鼠和酵母。然而该技术的基因修饰效率低，实验过程缓慢冗长。 真正推动基因组编辑技术向前发展的是通过生物体自身特异性识别DNA序列的特殊蛋白结构，加入人工再设计的思路，使之能够特异性地识别靶标序列，特异性定点切割DNA双链，大大提高同源重组和非同源末端连接的频率。这一发现促进了一系列基因组编辑技术的发展，使在基因组水平上进行精确的基因编辑成为可能。 （点击查看大图） 在基因编辑技术的建立和优化过程中需要解决的技术问题包括gRNA效率的验证、快速而灵敏地检出稀有编辑事件以及优化HDR:NHEJ效率。这都需要有快速简便的基因编辑效率的评价工具。 或许您听过T7E1核酸酶/Surveyor分析法：通过 PCR扩增野生型和基因编辑后的基因组 DNA，扩增出含突变的PCR片段，将野生型和突变型PCR 产物进行变性退火杂交，再用T7E1核酸酶切割杂交后的 PCR 产物，通过琼脂糖凝胶电泳，则可快速检测出DNA双链是否发生了突变。然而，这类方法是仅半定量，灵敏度有限，容易产生假阳性/假阴性，且如果存在序列多态性时容易受高背景信号影响。 或许您还听过PCR-RFLP法：限制性片段长度多态性分析，通过PCR扩增出基因编辑后的基因组DNA，获得突变位点的PCR片段，然后根据突变位点附近特异的限制性内切酶切割PCR片段，通过琼脂糖电泳分型来检测是否发生了突变。这种方法检测成本较低，但受限于DNA序列上的酶切位点，若突变后酶切位点未破坏，则会漏检突变体。 HRM，高分辨率熔解曲线分析技术，基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态的熔解曲线的原理进行分析，其在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线来检测突变，熔解曲线取决于 DNA序列、长度和 GC含量等， 可以检测样品突变 、单核苷酸多态性和甲基化。该方法检测灵敏度和特异性都较高，但细胞中存在的天然SNP位点会干扰对基因编辑位点的判定。 对于基因编辑效率的检测，Bio-Rad可提供从细胞、核酸、蛋白三大层面的整体解决方案： Bio-Rad快速、准确检测基因编辑效率的方法是直接裂解，再利用结合微滴式数字PCR（ddPCR）技术进行检测。 实验步骤： 1. 采用CRISPR/Cas9方法将细胞进行NHEJ基因编辑 2. 将经基因编辑的细胞分成两部分，一部分采用柱纯化法提取gDNA，另一部分直接采用Bio-Rad SingleShot Cell Lysis Buffer（# 1725080/ #1725081）进行细胞裂解 3. 同时利用ddPCR技术进行基因编辑效率检测，最后对比分析步骤2两种处理方法的结果一致性 （点击查看大图） 实验结果： 1. ddPCR微滴分簇2-D图。A：SingleShot直接裂解 ; B：柱纯化提取gDNA，对比可知分簇效果一致，直接裂解法不影响ddPCR实验。 （点击查看大图） 注：ddPCR检测NHEJ基因编辑效率时，采用Drop-Off引物探针设计原理，见下图。野生型模板可检测出两种荧光信号；突变型模板仅可检出一种荧光信号。 （点击查看大图） 2. NHEJ基因编辑事件/效率绝对定量。A：编辑效率百分比；B：微滴数，对比可知两种处理方法均无显著差异。 （点击查看大图） 综上所述，SingleShot细胞裂解Buffer结合ddPCR基因组编辑效率检测，可为客户提供一个精简的工作流程。该流程绕过了单细胞有限稀释和柱纯化gDNA提取的需求。整个过程可以在转染结束后立即进行，并在<4小时的时间内、用<1小时的手动操作时间，对基因组编辑事件进行绝对定量，结果可靠，准确。 注：上述数据源于Bulletin 7155, Bulletin 6947, Bulletin 7065 本产品仅限科研使用，不作为临床诊断。 Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。 这是一个广告 |
|
|
