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【述评】病原体分子诊断技术在下呼吸道感染诊断中的应用及其价值

2019-08-09  洞天禅悟

文章来源: 中华结核和呼吸杂志,2019,42(7):486-489

DOI:10.3760/cma.j.issn. 1001-0939. 2019. 07. 003

作者:瞿介明 刘海霞

单位:上海交通大学医学院附属瑞金医院 复旦大学附属中山医院

摘要

病原体检测是肺部感染精准治疗的基础,也是疾病得以有效防控的前提。基于微生物培养和分离的传统病原体检测技术存在阳性率低、周期长、精确度较低等局限性,无法满足下呼吸道病原体精准诊断的需求。快速、精准的分子检测新技术可有效弥补传统病原体检测方法的不足。本文将从病原体分子诊断技术及其在下呼吸道感染诊断中的应用及其价值方面进行讨论。

 呼吸道感染是临床常见疾病。在世界范围内,呼吸道感染在成人及儿童常见疾病中的发病率及病死率居于第2位,在全球疾病负担排名中仅次于缺血性心脏病[1,2]。呼吸道感染可由细菌、病毒、真菌等多种病原体引起,病原体检测是肺部感染精准治疗的基础,也是疾病得以有效防控的前提。但呼吸道感染病原学构成复杂,临床诊断中病原体的判断较为困难。近年来,因新型耐药菌的出现、机会性感染的增加及病原谱的变迁,增加了病原学诊断的难度。

一、传统病原体诊断技术:面临局限

传统的病原体检测技术主要是基于微生物培养和分离,技术成熟,阳性预测价值高,在病原体的鉴定中仍发挥着重要作用。微生物的分离培养需要依赖于病原体的活力,但相当一部分病原体无法通过体外培养检出,因此存在阳性率低、周期长、精确度较低等局限性。相关研究结果表明,70%左右的感染患者因传统检测方法无法确定病原体,未能得到及时有效的治疗,导致疾病预后较差[3]。因此,建立并推广快速、精准的病原体检测新方法,对于适时、合理、有效防治感染性疾病具有重要意义。

二、病原体快速分子检测技术在临床诊断中的作用:当下有为

随着现代分子生物学技术日新月异的发展,基于分子遗传水平的核酸检测技术已成为病原体检测的主流发展趋势,它摆脱了传统检测方法对于病原体分离培养的依赖,显著提高了病原检测的敏感度,缩短了检测时间。分子生物学用于病原学诊断是从核酸检测开始的。核酸杂交技术是核酸检测的基础,最早是利用生物素、放射性同位素、酶等标记的探针与样品的核酸片段进行杂交,通过检测特异的杂交信号确定病原体,该技术检测的特异度和敏感度均较高,其后改良的荧光原位杂交FISH技术,在病原学早期诊断中起到了至关重要的作用。20世纪80年代开始,PCR技术逐渐广泛用于分子诊断领域,从最早的传统PCR,逐渐发展到多重PCR、巢式PCR、反转录PCR以及实时定量PCR等,其扩增能力和精确性逐步提高,其中基于多重PCR技术开展的多重病原体检测体系在疑似呼吸道病毒感染患者的病原体筛查和确认中具有较高的临床应用价值,大大提高了病原体的检出率,便于发现混合感染,在流感等新型病原体突发感染性疾病方面亦具有一定的应用价值。另外,PCR技术在检测病原体耐药方面也发挥了重要作用。采用PCR技术进行耐药研究,避免了病原体分离、培养及药敏试验等一系列繁琐冗长的步骤。近年来,利用核酸分子杂交原理,以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作为探针,通过对杂交信号进行检测分析迅速得出样本基因序列信息的基因芯片技术,进一步增大了检测通量,实现低拷贝模板检测,敏感度极高。随着多种PCR方法联合应用以及商用试剂盒的出现,使该项技术日臻成熟,并扩展应用于基因表达分析、疾病相关的新基因的发现、药物研究与开发以及各种已知或未知病毒性病原体的筛查与鉴定研究。与传统检测不易早期诊断、敏感度和特异性较低等局限性比较,PCR技术可早期、快速、敏感、特异性检测侵入体内的外源性基因(感染性病原体的DNA或RNA),不仅可以对微生物感染进行准确的病因学诊断,还可对感染性病原体进行基因分型和耐药性监测,在感染性疾病的临床诊断、流行病学调查、微生物分类分型研究中显示出其独特的功能。但由于PCR技术的敏感度高,极微量的靶基因污染也会造成结果判断上的失误,故非样品性靶基因污染所致假阳性问题较为突出。同时,尽管基于核酸检测的分子生物学检测有诸多优越性,但不能确定病原体是否具有生命活性,也不能说明检测出来的病原体核酸是否能得到表达,而且检测费用相对较高,需要特殊设备,限制了其在临床的广泛应用。

三、临床宏基因组学在病原体检测中的应用:未来可期

核酸杂交、PCR、基因芯片等分子生物学检测技术均以序列为基础,需要基于已知病原体的基因序列,对于完全新型'未知'病原体的检测价值有限。近年来,高通量测序技术在微生物检测中的开展应用,促进了不依赖培养的临床宏基因组学的发展,通过直接从自然状态下得到微生物组学的相关基因进行分类鉴定,将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体,摆脱了针对已知的单个或多个病原体进行意向性培养和分离的步骤,简化了检测流程,提高了病原检测的敏感度,缩短了检测时间,可对所有微生物进行分析,检出'未知'病原体及多种混合感染病原体,提供病原鉴定、分型、耐药基因和毒力因子分析,还可进行溯源分析,具有传统检测方法不可比拟的优势。尽管宏基因组学技术还不是常规诊断方法的一部分,但临床研究结果证明高通量测序在鉴定疑难、罕见感染病原及非典型病原体等常规检测技术鉴定难度大的病原体具有重要的临床应用价值。2009年H1N1流感暴发,通过宏基因组学技术迅速检出并获取了流感病毒的全基因组序列[4]。2011年,德国大肠杆菌O104∶H4暴发,在不到一周的时间内,通过宏基因组测序技术确认了疫情暴发是由耐药性肠聚集性大肠杆菌引起[5]。Towner等[6]通过宏基因组测序,明确了1株新型埃博拉病毒引起的乌干达出血性发热的暴发。2018年梅奥诊所将宏基因组测序技术用于人工关节感染的诊断[7],从408例失败的膝关节或髋关节置换术患者中收集了关节腔滑液,同时进行培养和宏基因组测序,结果发现115例培养阳性的感染病例,宏基因组测序在109例中发现了相同的病原体,一致性为86.1%,并在11例中额外检出了潜在的致病菌,其中4例用培养方法证实为多种细菌混合感染,而另外7例应用培养方法检测为单一致病菌感染,应用宏基因组测序发现了至少1种新的潜在致病菌;宏基因组测序在98例培养阴性的感染病例中发现了43例存在潜在的病原体,其中大部分检出的病原体为关节感染常见的致病菌,检出唾液支原体感染1例,既往报道发现其可作为导致人工关节感染的一种新型致病菌。对于195例非感染性关节置换术失败的患者,宏基因组测序检出7例患者存在潜在的致病菌,与培养结果一致性高达96.4%。这些结果表明,与传统培养检测比较,宏基因组测序技术对于病原体的检出阳性率提高了近1倍,尤其是针对培养阴性的临床样本,宏基因组测序的价值较高。这些研究说明宏基因组测序技术是对传统培养鉴定方法的一种较好的补充手段,有助于解决目前病原体检出率低的临床窘境,具有较高的临床应用价值。

分子检测技术在临床应用尚需解决许多问题,传统实验室培养可涵盖临床常见的病原菌,具有一定的靶向性,通常包含定量元素,可设定特定的临界值(cut-off值)进行定量分析,阳性预测价值较高。分子检测技术敏感度较高,可检出大量微生物,其中宏基因组测序的敏感度最高,可无靶标测定标本中所有的微生物,阴性预测价值较大,但同时给临床结果的判读带来了挑战。同一样本通过测序可检出多种病原体,但无法判断这些病原体是否为致病原,而不是感染菌和定植菌的混杂,或是仅为背景菌的污染。若无法准确辨别感染'元凶'时,这些检出信息可能会影响医生的判断。宏基因组测序技术还面临人来源的核酸污染、核酸抽提效率偏低、缺乏标化测序、生物信息学分析流程以及报告解读水平不一等问题。

由于呼吸系统特殊的解剖结构,下呼吸道标本采集困难且容易被上呼吸道菌群污染,下呼吸道微生物负荷量相对较低,因此标准采样问题一直是下呼吸道病原体研究的瓶颈问题之一。宏基因组测序技术又因其高敏感度及对微生物信号的放大效应,对样本的合格采集及代表性提出了更高的要求。根据是否会受到上呼吸道菌群污染分为两类:一类是存在有口咽菌群污染可能的方法,如痰液检查、经气管插管吸出物检查、支气管镜技术(包括经支气管镜吸引、支气管肺泡灌洗及保护性毛刷等);另一种是避免了上述污染的方法,如胸腔积液培养及肺活检组织标本等。原则上应按照先易后难、先无创后有创的原则选择不同的诊断方法,但采用宏基因组测序技术所获得的测序数据中只有<5%的微生物序列,因此,在呼吸道标本采集过程中需根据临床实际情况选择合适的样本,以提高病原学的诊断能力。

众所周知,痰液不可避免要受到口咽部细菌的污染,并不是下呼吸道感染最理想的检测样本,诊断的敏感度及特异度不高,但由于痰样本采集为无创操作,较为方便,在临床中的应用价值较高,目前仍是下呼吸道病原体检测中最主要的样本类型。鉴于宏基因组测序的高敏感度,即使在规范痰液采样的前提下仍可检测出大量呼吸道定植菌,给致病菌的判别带来了挑战,因此肺部感染患者初步的痰标本的诊断应以更经济及便利的传统微生物检测技术为主。在传统微生物检测技术检测阴性且治疗效果不佳的患者、因病情危重需尽早明确病原菌的患者、特殊病原体以及传统微生物检测方法难以分离病原体的情况下才可考虑采用高通量测序技术。痰标本的高通量测序结果需结合流行病学、临床特征等综合分析,审慎确定致病菌。采用经鼻或经口的不同解剖学途径采集的下呼吸道样本,检测到的微生物群落信息并无显著差别,提示上呼吸道污染对经支气管镜获得的下呼吸道样本微生物群落的影响较小[8],因此,经支气管镜的支气管肺泡灌洗和保护性标本刷检是目前较为理想的检测下呼吸道微生物的采样手段。

血标本采集方便、安全,且污染机会少、特异度高,在病原学诊断上具有特殊意义,但由于血培养阳性率相对较低,常被临床忽视。文献报道肺炎伴发菌血症的机会为5%~10%,重症和免疫抑制患者则更高。肺炎患者血和痰样本中检测到相同的细菌时可确定该菌为肺部感染的病原菌。如仅血液检测阳性,但不能用其他原因如腹腔感染、静脉导管解释菌血症的原因时,血液中所分离的细菌亦可认为是肺部感染的病原菌。因此,对重症,特别是免疫抑制宿主的肺炎,传统检测方法无法检出致病菌时,可尽早采血进行高通量测序检测。

此外,采用侵入性方法获得的肺组织或胸腔积液为无污染的微生物标本,出现阳性结果时对临床治疗有着非常重要的指导意义。肺炎患者伴发胸腔积液比较常见,占10%~50%,任何明显的积液在胸膜腔内都可通过胸腔穿刺术取样。对于不明原因的肺部感染性疾病、疑似特殊病原体感染及因病情危重需尽早明确病原体的患者,如其他样本无法诊断时,可推荐采用侵入性检查获取肺组织或胸腔积液等无菌样本进行宏基因组测序。

临床宏基因组测序是实现呼吸系统感染性疾病精准诊疗的关键技术,但目前缺乏统一完善的检测流程和质量控制标准,尚不能全面应用于临床,目前宏基因组测序主要用于常规检测方法无法直接检测或难以区分的病原微生物、疑难或重症感染患者。在临床工作中还需要结合流行病学、临床特征等对宏基因组测序结果进行综合分析,必要时联合多种检测方法,如将定量PCR与测序技术联合进行临床检测结果的解读,去伪存真,以确定真正的致病菌。此外,部分分子检测技术对实验条件、设备及操作水平要求较高,尚不能在基层普及。在临床实践中,传统的检测方法和分子生物学检测方法互为补充、平行送检可有效提高病原的检出率。随着研究的深入,多种检测技术的联合应用会越来越多,新型分子检测技术在临床管理中的指导价值越来越受到重视,发展前景广阔。

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