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《神雕侠侣》截图（来源：网络） 编者按：钩吻 (Gesemium elegans) 属于马钱科(Loganiacease)植物钩吻属，始载于《神农本草经》，古人认为此草入口即钩入喉吻，故曰“钩吻”。或谓“吻当挽字解牵挽人肠而绝之”，故又曰“断肠草”，是著名的有毒植物。传闻神农氏尝百草,后来误食断肠草而死。，在古代，钩吻已被用作治疗类风湿性关节炎、神经性疼痛、痉挛、皮肤溃疡和癌症的传统中药，在《本草纲目》，《梦溪笔谈》中均有记载。金庸小说《神雕侠侣》中，杨过更是靠着服用断肠草，一举解了情花之毒，十六年后得以与小龙女重逢于绝情谷底。但是民间常有不遵循使用原则或者误服导致中毒事件屡有发生，严重则导致死亡。因此，钩吻的化学成分研究及作用机制一直受到化学家、药理学家和毒理学家的关注。 湖南农业大学动物医学院孙志良教授和刘兆颖副教授所领衔的钩吻研究团队针对钩吻已经开展了五年多的一系列研究工作。目前已经明确了钩吻的药理活性成分与毒性成分，建立了钩吻化学成分研究数据库。近年来随着全基因组测序的迅速发展，使得从全基因组层面通过揭示植物的系统发育特点，从而深度挖掘钩吻中毒性成分的合成代谢途径。2019年8月，药学权威杂志Acta Pharmaceutica Sinica B 杂志在线发表了来自湖南农业大学钩吻研究团队题为Whole-genome sequencing and analysis of the Chinese herbal plant Gelsemium elegans的研究论文（图1）。该研究完成了钩吻全基因组测序、组装，获得了染色体水平的高质量全基因组，也是目前首例马钱科植物的全基因组报道。钩吻基因组图谱的成功绘制揭示了钩吻生物碱的可能生物合成途径的关键基因，为钩吻素己等毒性成分的生物合成奠定了坚实基础，为解析钩吻毒性的物质作用基础研究提供科学依据。 图1. 药用植物钩吻全基因组分析 论文详细解读 钩吻，又名断肠草、野葛等，是世界著名的大毒植物。在全世界一共有三个种属，分别为：胡蔓藤（Gelsemium elegans Benth）主要分布在我国福建、浙江、云南、广西、等南部地区及东南亚地区；常绿钩吻（G. sempervirens (L.) J.st-Hil）以及沼泽茉莉（G. rankinii Small.），主要分布于北美洲国家。中医对钩吻早就记载，如《中药大辞典》中描述：其根、茎、叶均可入药，性温，味辛、苦，有大毒。民间因其毒性大，常用来治疗人类风湿性关节炎疼痛，神经性疼痛，痉挛，皮肤溃疡和癌症。然而，钩吻却对一些动物有促进生长的作用，如《唐本草》云“人或畜食其叶皆死, 羊食则大肥，猪食之能治热性病”。 传统的钩吻物质基础研究思路是采用西方的天然药物研究思路，即对钩吻中的化学成分进行有目的的提取、分离与纯化，再用质谱与核磁进行结构鉴定，不断发现钩吻中新的化学成分，筛选到一些有生物活性的有效成分，从而阐明钩吻的物质基础。早在 20世纪 50年代国内外就开始了钩吻化学成分分离与结构鉴定研究。目前，国内外许多学者通过大孔树脂、ODS反相硅胶、Sephadex LH-20、逆流色谱以及制备型HPLC等现代分离技术手段从钩吻中分离得到了生物碱、环烯醚萜和甾体等100多种化学成分。以上的研究方法对钩吻化学成分研究得比较清楚，结构式准确，发表的研究结果对后人研究起着很好的借鉴作用，并阐明了钩吻存在许多有效成分。目前国内外有关钩吻在体内的药理作用研究主要集中在钩吻含量较高的钩吻素子与钩吻素甲，并对它们的抗肿瘤、免疫调节、抗焦虑、抗炎镇痛等药理作用机制进行了深入研究。但几个有效成分的药效研究结果并不能反应钩吻多组分、多靶点从整体上所起的作用，其研究思路与方法不符合中药整体理论研究。而且，相应的研究结果不能真正地揭示钩吻作用的物质基础。 2015年开始，孙志良教授和刘兆颖副教授团队开始围绕钩吻的化学成为与毒性等科学问题，从钩吻植物化学、代谢、药代动力学、残留分析，毒理学等方面开展系统深入的技术与基础研究，为深入研究钩吻毒性成分的生物合成与毒作用机制提供了重要的技术支撑与科学基础。 1、 建立了一种快速检测与鉴定钩吻化学成分的分析方法策略，为进一步研究钩吻物质基础、代谢与残留提供了技术手段 团队采取了基于液相-四级杆-飞行时间串联质谱（LC-Q-TOF-MS）技术结合钩吻数据库构建的新技术进行了钩吻体外物质组的研究 (Liu et al., 2017a )。根据国内外研究钩吻化学成分的研究结果，应用PCDL软件构建了204种钩吻单体化合物数据库。再采用LC-Q-TOF- MS对钩吻提取物中化学成分进行目标检测与鉴定，已鉴定出钩吻提取物中57种化学成分，其中含43种生物碱，9种环烯醚萜及少量甾醇与香豆素化合物。该技术快速、准确地实现了对钩吻复杂体系中化学成分的检测与鉴定，且具有进样次数少、操作简单、分析效率高等优点。目前，该技术已获国家发明专利（授权专利号：ZL201510968431.1）。在此基础上，进一步研究了不同产地、不同部位的指纹图谱，用LC-Q-TOF-MS鉴定出钩吻中41种体外化学成分组（图2），并对钩吻中六大类生物碱的质谱裂解规律进行了解析 (Liu et al., 2017a)。这些研究成果解决了钩吻在无对照品情况下进行多组分检测与鉴定的技术难点，为进一步研究钩吻多组分在体内的作用物质基础研究提供了新思路。 图2：钩吻中鉴定的体外化学成分组 2、研究了钩吻中主要生物碱钩吻素子和钩吻素甲的代谢方式，为后续研究钩吻多组分的整体代谢研究奠定了坚实的基础 采取基于LC-Q-TOF-MS 的代谢研究技术体系，研究了钩吻素子与钩吻素甲在大鼠、猪肝S9中的代谢。在大鼠肝S9中共鉴定出9种钩吻素子代谢产物，猪肝S9中共检出6种代谢产物。钩吻素子的主要代谢途径是N-去甲基、氢化和氧化，其中7个钩吻素子代谢产物是首次在大鼠肝S9检出（图3）(Yang et al., 2018 a)。 图3. 钩吻素子在大鼠的代谢途径 3、完成了钩吻中3种主要有效成分在猪血浆中的定量方法学研究，为建立钩吻多组分在血浆与组织的定量分析方法奠定了基础 团队采用LC-MS/MS建立了同时测定钩吻素甲、钩吻素子和胡蔓藤碱甲在猪血浆中的分析方法，优化了该3种有效成分的质谱参数和血浆前处理方法。血浆样品经酸化乙腈处理，低温下氮气流吹干，用甲醇-酸水复溶。按FDA生物样品分析指导原则进行了方法学研究，结果表明方法特异性良好，基质效应干扰小，3种有效成分的定量限为0.2ng/mL，线性范围的相关系数大于0.99，精密度和准确度高，回收率好，满足钩吻在猪血浆的定量检测要求 (Yang et al., 2018 b)。 建立了一个同时检测钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己的二维液相色谱（2D-LC）方法(Liu et al., 2019 b)。2D-LC由第一维离子交换色谱（IEX1）柱 - 捕集柱 - 第二维反相色谱（RP2）柱组成，检测的生物样品包括血浆、尿液和组织（肌肉、肝、肾），样品采集后经过简单的蛋白沉淀或离心后直接大体积进样。化合物在第一维离子交换色谱柱上进行初步分离和富集，通过捕集柱截取目标化合物进行保留，然后转移到第二维反相色谱柱。其方法为钩吻的残留毒理分析，药代动力学研究和临床中毒诊治提供技术支撑。 4、基因组水平解释钩吻生物碱的合成途径基因 团队在前期的基础上，利用Nanopore Hi-C技术组装了高质量的钩吻基因组，组装完成的钩吻基因组大小约为335.13Mb，其Contig N50达到了10.23Mb，这在非模式植物尤其是药用植物资源全基因组研究中是十分少见的结果，说明本研究采用的Nanopore测序与二代测序相结合校正的技术对于非模式植物有着很好的组装效果；重复序列占比43.16%，26，768个蛋白编码基因得到了从头或基于同源基因的功能注释；通过BUSCO分析得到了92.9%的组装完整性评估。同时，研究组还采用了高通量染色体构象捕获High-throughput chromosome conformation capture, Hi-C)技术实现了通过对染色质内全部DNA 相互作用模式进行捕获，将钩吻基因组草图，高精度地定位到了8条染色质，从而构建了完整的钩吻染色质的序列位置结构信息（图4）（Liu et al. 2019a）。钩吻的基因组序列可以作为马钱科比较基因组分析的一个有价值的来源，并将有助于理解吲哚生物碱代谢的系统发育关系和植物物种的进化反应。 图4 钩吻全基因组研究流程图 该论文第一作者为柳亦松副教授，唐其副教授与程辟副教授为论文共同第一作者，论文通讯作者是孙志良教授与刘兆颖副教授，湖南农业大学为论文第一和通讯单位。本研究得到了湖南省杰出青年基金项目、国家重点研发计划、国家自然科学基金与湖南省自然科学基金的资助。 专家点评 宋驰（中国中医科学院中药研究所数据中心主任） 主要研究领域：药用物种基因组及资源鉴定研究；基于高通量测序技术的大数据研究。 Comments：随着基因组、转录组等大数据的广泛应用，通过多种学科交叉融合加速植物天然产物基础研究和产业开发的例子已在多种植物中得以验证，这对于研究工具匮乏的中药材等非模式植物尤为重要。通过团队间密切合作首次揭示了马钱科植物基因组，为从全基因组水平系统发掘钩吻生物碱的代谢通路创造了条件，共遴选出多个关键基因， 揭示毒性低的钩吻素子与素甲以及毒性高的钩吻素己与素已的代谢网络仅仅是第一步。以基因组数据为基础，有望进一步揭示参与生物碱合成的关键代谢酶，这是该研究领域未解的重要科学问题，而上述研究中已发现了非常明确的线索。 Woo Kim（佐治亚大学农业与环境科学学院教授） 主要研究领域：饲料添加剂对生长性能和养分利用的影响;家禽抗生素替代品的鉴定和开发；矿物质营养与家禽骨骼生长；肠内营养吸收和转运(氨基酸和矿物质) Comments：低剂量抗生素在饲料中的添加使用曾为动物的健康养殖做出了巨大的贡献，但是随着抗生素用量的增加和滥用导致耐药性和超级病菌的出现，对环境和公众健康产生了潜在的严重威胁。天然生长促进剂（NGPs），如植物来源产品被广泛地用于畜禽生产中，并有希望作为抗生素的替代品。钩吻研究团队围绕钩吻的化学成分与活性等科学问题，从植物化学、代谢、药代动力学、残留分析，毒理学等方面开展了系统深入的技术与基础研究，为深入研究钩吻主要成分的生物合成与作用机制提供了重要的技术支撑并为进一步的产品开发奠定了科学基础。 |
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