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轮枝孢菌(Verticillium Nees)在分类上被划归为有性生殖不太明了的半知类真菌,目前被报道的已有40余种,均是土壤中的常见真菌。该属真菌的种间差异较大,依据形态学指标被分为5个型;依其生物学习性又可分为3大类,即土源性腐生菌,昆虫、植物线虫和蘑菇线虫的兼性寄生菌,以及严重危害农作物的病原菌。目前,菌种的鉴定主要由形态学和生长习性两个特征综合确定,但由于其为半知类菌,所以对该属内一些种的确切分类地位仍需完善。厚垣轮枝孢菌为该属12种噬线虫的轮枝孢菌之一,根据其瓶梗分生孢子呈链状或是呈头状排列,又可细分为2个变种,即厚垣轮枝孢串孢变种和厚 垣轮枝孢厚 孢变种。在植物线虫生物防治上有重要意义的就是厚垣轮枝孢厚孢变种。 一、生物学习性 1、生长特点。 厚垣轮枝孢菌是一种兼性寄生菌,既能在土壤中营腐生生活,又能寄生于植物根围区的球形胞囊线虫、胞囊线虫 和根结线虫等固着性较强的植物线虫的雌虫、胞囊、卵囊或虫卵内。该菌虽然也可侵染植物的根表皮,但不能进一步侵染根内部的维管层,所以不会致病于植物。 厚垣轮枝孢菌的营养菌丝呈匍匐状生长,分隔、分枝、淡白色。气生菌丝薄,瓶梗常从平卧菌丝上单生或2～3个轮生,顶端产生单细胞核的分生孢子,易脱落,圆形或椭圆形,微带色泽。砖格状多细胞核的厚垣孢子由气生菌丝细胞质浓缩、外壁增厚而形成,是一种无休眠性的孢子,这种孢子在营养丰富和正常环境下都能大量产生。厚垣孢子对高温、干旱的耐受力比分生孢子和菌丝强,更易在土壤中存活,所以生防时主要用这种孢子对土壤接种。 2、分离培养及营养需求 植物根围土壤中的习居菌物种类多,所以用常规培养基分离纯化厚垣轮枝孢菌比较困难。一般用含有苯来特、苯丙咪唑或塞菌灵等的半选择培养基分离纯化厚垣轮枝孢菌,这些药物对厚垣轮枝孢菌不敏感,但对土壤中其他真菌有杀灭作用,作用靶点是菌丝的β-微蛋白管。Crump等报道,厚垣轮枝孢菌可以在麦麸、大麦、小麦杆及粗沙混合组成的原料上生长。Mauchline等将厚垣孢子接种于经γ-射线消毒的富含有机质的沙质肥土上,结果表明其能良好生长。cPCR法检测发现,接种1周后土壤中的菌物生长即可达到高峰。张虹等对厚垣轮枝菌的实验室培养条件进行研究发现,其在草炭培养基、麦麸培养基、麦粒培养基及玉米培养基中均能良好生长,最适生长温度为25℃,最适pH值为6。 3、动态变化 厚垣轮枝孢菌生活史包括菌丝体、单细胞的分生孢子和多细胞核的厚垣孢子3个阶段,所以跟踪其施入土壤后的动态变化比较困难。常规的平板直接计数法描述的是生殖芽在平板上的克隆,不能说明这种生殖芽到底是由菌丝片段、单细胞的分生孢子还是由多细胞的厚垣孢子所引起。Penny等用半选择培养基法、菌丝β-微管蛋白基因扩增法及单克隆抗体法,分别对厚垣轮枝孢菌在根围中的动态变化进行了研究,发现3种方法各有长处,其中特异性极强的单克隆抗体法对观察菌物在植物根围的定殖及其对线虫的侵染情况非常有用。Mauchline等采用半选择培养基平板计数法与cPCR法,对厚垣轮枝孢菌的生长情况进行测定,认为cPCR虽然可以从菌物的基因拷贝角度较好的反应其生长情况,但cPCR法的不足之处在于已死亡菌物的DNA也可被扩增,所以只有2种方法相结合才能更好地阐明菌物的动态变化。 二、噬线虫机制 1、侵染 厚垣轮枝孢菌的菌丝网依靠一种目前尚不清楚的识别机制对线虫雌虫及虫卵等进行识别。Morgan-Jones等在透射电镜下,观察了厚垣轮枝孢菌对花生根结线虫卵的侵染过程:首先在卵壳表面侵染点处形成附着器,然后形成很细的侵染丝进入卵壳,一旦入侵,即在卵内形成侵染泡。Chen等观察了厚垣轮枝孢菌侵染大豆胞囊线虫的情况,当胞囊表面的菌丝开始侵染时,侵染停留在侵染点或随菌丝进入胞囊,从而在胞囊壳上留下许多小孔,胞囊内的侵染钉直径一般小于1μm,比正常的营养菌丝细得多。 2、消解 当厚垣轮枝孢菌侵入雌虫和虫卵后,就开始消解并吸收其中的营养物质,这一过程涉及到2类重要的酶,即蛋白酶和几丁质酶。一些学者对厚垣轮枝孢菌分泌的蛋白酶进行了纯化和定性分析,发现这些酶均属于枯草杆菌蛋白酶类,并具有很高的同源性,其中1种蛋白酶VCP1分子质量为33000 u,等电点为10.2,可以水解凝乳蛋白酶基质、弹性蛋白、酪蛋白等。Sergrs等用原位杂交法观察到纯化的VCP1可水解南方根结线虫虫卵的外层壳膜,直至虫卵壳的几丁质层暴露。Dackman等较早检测到了厚垣轮枝孢菌可分泌几丁质酶,并且发现几丁质酶活水平与其对甜菜胞囊线虫的致病 性成正相关。Tikhonov等将厚垣轮枝孢菌培养于胶质状的角质素上,培养18～20d后再进行过滤,收集滤液并进行几丁质酶的提取和纯化,测定其分子质量为43000u,最适pH值是5.2～5.3;并用扫描电镜观察了该酶对马铃薯白色球形胞囊线虫卵的作用情况。 三、生物防治的应用 1、自然控制 自然控制指通过土壤中本身存在的拮抗微生物来抑制线虫的数量,主要表现为自然环境下土壤中的植物线虫数量及其危害情况逐渐下降的现象。Kerry等跟踪调查了同一地块单作禾谷类作物时,发现在前2年,土壤中燕麦胞囊线虫的群体数量增长到高峰而造成减产,随后线虫数量迅速下降,研究证实这主要是由于厚垣轮枝孢菌对燕麦胞囊线虫卵及雌虫的寄生所致。Stirling等在澳大利亚调查发现,燕麦胞囊线虫在土壤中的天敌也是厚垣轮枝孢菌。自然控制虽然可起到抑制线虫数量的作用,但形成这种拮抗反应比较慢。不过这种生防系统一旦建立,便可较长时间地将线虫对作物的危害控制在经济阈值以下。 2、引入控制 引入控制指人为地将噬线虫的生防剂施入土壤直接防治线虫。据报道,引入厚垣轮枝孢菌控制根结线虫的试验效果都较好。Leij等将厚垣轮枝菌引入田间土壤,土壤中的根结线虫数量可减少90%。杨树军等研究了厚垣轮枝孢LZ1菌株对危害云 南烟草的南方根结线虫的卵囊和分 散化卵囊孵化的影响,结果表明该菌对分散卵的相对抑制率达27.15% ,而对卵囊的相对抑制率常可高达67.53%。林茂松等用分离到的1株噬线虫能力强的厚垣轮枝孢菌,于温室盆钵内进行防治南方根结线虫的试验,发现接种病土重量0.1%的菌剂量,即可明显降低番茄根上的线虫群体数量和根结指数,卵寄生率达53.7%;接种病土重量1%的菌剂量,番茄植株地上部鲜重平均比对照组重3.3g,每克根长比对照组增长近1倍。 四、影响生物防治的因素 1、土壤环境 噬线虫真菌的丰富度与土壤含沙量、有机质含量、重金属含量及土壤pH值有关,在沙性、有机质含量高以及偏酸性土壤中,噬线虫真菌较丰富;土壤湿度对噬线虫真菌活性也有影响,土壤湿度过高或过低都影响真菌对线虫的侵染。在试验情况下,铜、镁离子对厚垣轮枝孢菌生长均有一定程度的抑制作用,并且这种抑制作用随离子浓度的增加而增强。此外,植物根围土壤中的其他微生物群落对噬线虫真菌的生防效果也有重要影响。Bok-A-Bin分析了蕃茄和土豆根围中的根结线虫卵囊表面的微小生物群落的组成情况,发现卵囊表面的细菌和真菌组成极其丰富,其中有20种细菌尚不能在生物数据库中查到;其进一步测定这些细菌和真菌对厚垣轮枝孢菌生长的拮抗性,发现23%的细菌和74%的真菌表现出拮抗性,其中假单胞菌的拮抗性最强。 2、寄主植物 在植物线虫的生防中,厚垣轮枝孢菌在不同植物根围的定值优势差别较大,影响着生防效能。比如蕃茄和甘蓝的根围比土豆的根围更有利于厚垣轮枝孢菌的定殖。此外,植物如果对线虫特别敏感,线虫寄生引起的虫瘿过大,这将使得大量的卵块被埋藏于根内而很难受到菌物的攻击,此时菌物的防效就会受到影响。这种现象在蕃茄受北方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫寄生时表现得尤为明显。 3、菌物本身的差异 Mauchline等用根结线虫(RKN)和土豆胞囊线虫(PCN)分别感染蕃茄,然后用1株从PCN处分离到的厚垣轮枝孢菌对其进行生物防治,并用cPCR对上述蕃茄根围中的厚垣轮枝孢菌物进行定量测定,结果发现感染PCN的蕃茄根围土壤中,厚垣轮枝孢菌比感染RKN的蕃茄根围中的菌物数量多。这说明从被侵染线虫(卵)中分离出来的厚垣轮枝孢菌对该线虫的生防效更好,有一定的宿主特异性。林茂松等从山东、江苏的大豆胞囊线虫和南方根结线虫卵中,筛选分离厚垣轮枝孢菌,发现不同来源的菌株其卵寄生率差异很大。 五、展望 1、生态学研究 线虫生物防治的研究历史表明,生防菌往往对试验情况下特定作物的目标线虫防治效果较理想,而在田间效果则不稳定。这主要与田间的生态环境有关,因此需进一步从生态学的角度来研究噬线虫菌物施入田间后的情况。例如植物、线虫和厚垣轮枝孢菌之间的复杂营养关系;菌剂与土壤中其他微生物的拮抗性,土壤的酸碱度、温湿度及养分等理化因子对生防菌的影响;生防菌被用于土壤后的生长、繁殖、存活、扩散能力等。随着这些问题的不断解决,将进一步提高生防菌对线虫的防治效果。 2、剂型研究 生防菌在商业生产上常用于进行液体培养,以大量生产孢子和菌丝。但颗粒型的生防菌剂最便于田间土壤施用,所以有学者建议将菌物装入藻酸钠之类的胶凝剂后制成固体剂型使用。Jones等研究证实,硅藻盐、糖蜜、褐煤及粘土等混合做成的小料培养基,很适合厚垣轮枝孢菌的生长;Kerry也在颗粒状的藻酸盐与麦麸混合培养物上培养厚垣轮枝孢菌,发现大约可以长出长达1cm的菌丝。这表明对颗粒型生防剂的研制是可行的,也是今后的努力方向。 3、菌株的选育 从自然衰退的土壤中,或根据当地植物种类,有选择地从野生型菌株中筛选出噬线虫能力强的生防菌,这一直是各地学者普遍使用的方法。如英国洛桑试验站一直致力于厚垣轮枝孢菌株防治根结线虫的研究,已筛选出VC10等防效较好的菌株。此外,利用现代分子生物学技术进行菌株的选育也是很有前景的。当找到了生防菌编码线虫体壁降解酶的基因或与杀线虫毒素相关联的基因,就可以将其作为探针去筛选其他噬线虫能力更强的菌株。利用遗传工程也完全有可能改变体壁降解酶的结构,使其更具有降解活性、专化性和稳定性,最终可将编码这种酶 的基因转入到其他生物中来防制植物线虫。 4、综合防治 措施每种生防菌都有一定的使用限制,即只能侵噬某类线虫或线虫的某个生活阶段,所以可以根据实际情况,在生产上采用数种生防菌剂联合应用。还可以借用其他抗线虫方法,比如说翻晒土壤,培育抗线虫作物 ,甚至可以与低剂量、易分解、对生防菌生长影响小的杀线虫药物一起使用来控制植物线虫。此外,还应向土壤中多施有机肥,提高土壤肥力,以利于生防菌和植物的生长,特别是向土壤中添加几丁质可以刺激厚垣轮枝孢菌的活性,提高其对线虫的寄生率。 参考文献 [1]Thomason IJ.Challenges facing nematology:environmental risks with nematicides and the need for new approaches[A].Veech J A, Dick-son D W.Vistas on nematology [C].Hyattsville,USA: Society of Nematologists,1987.469-476. [2]裴正非,潘沧桑.杀线虫真菌节丛孢属(Arthrobotrys)研究进展[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2003,31(增刊):173-178. [3]刘杏忠.中国食线虫真菌的分类学及生态学研究[D].北京:中国农业大学,1991.
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