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经好久没有写技术性文章了，有点生疏，措辞不太合适的地方，还望各位大佬们多多包涵~ 小编最近迷恋上了外泌体的研究，在此分享一下，也希望能让大家长些知识。 【Endoplasmic Reticulum Stress Promotes Liver Cancer Cells to Release Exosomal miR-23a-3p and Up-regulate PD-L1 Expression in Macrophages 内质网应激促进肝癌细胞释放外泌体miR-23a-3p并上调巨噬细胞中PD-L1的表达】 孙国平、王华课题组的研究人员在Hepatology杂志发表文章，发现ER应激下的肝癌细胞通过外泌体将特定的miRNA转移到浸润巨噬细胞从而影响PD-L1的表达，进而促进肝癌细胞的免疫逃逸。 那么，内质网应激到底是如何影响PD-L1表达呢？ 导语 1. 肝细胞癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤，在全世界生存率很低。手术是HCC患者最有效的治疗策略，但超过80％的患者在确诊时已无法完全通过手术切除。因此，迫切需要对HCC开发更有效的系统治疗方式。内质网应激下的肝癌细胞将特定的miRNA通过外泌体转移到肿瘤微环境中的浸润巨噬细胞来促进肝癌细胞的免疫逃逸，为肝癌治疗提供了新的有效策略。（什么是内质网应激，大家可以看本期第二篇文章） 2. 外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯。HCC细胞来源的外泌体可转移miR-23a-3p进而增加PD-L1的表达（miR-23a-PTEN-AKT）。T细胞与Exo-TM（exosomes derived from tunicamycin treated HCC cells）刺激的巨噬细胞共培养降低了CD8+ T细胞比率并减少白细胞介素-2产生，并增加了T细胞凋亡，这些结果表明miRNA是外泌体介导的细胞间通讯的重要分子。 3. 研究结果表明，在肿瘤细胞免疫逃逸过程中， miR-23a-3p通过外泌体（ER应激的HCC细胞）向巨噬细胞的转移发挥着重要作用，该研究结果为肿瘤细胞如何逃避抗肿瘤免疫提供了新的见解。 研究思路 文章涉及的技术方法 流式细胞术（FCM） 免疫组化（IHC） 免疫荧光（IF） 免疫印迹（WB） 定量聚合酶链反应（qPCR） 高通量测序（HTS） 液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS / MS） 研究结果 1. 人类HCC中ER应激被激活 免疫组化结果显示WB、qPCR结果表示，ER应激相关的蛋白（GRP78，PERK，ATF6和IRE1α）在HCC组织中均高表达。（Figure1） 2. ER应激的激活与人HCC的不良生存相关——Kaplan-Meier 曲线表示，过表达GRP78、ATF6、PERK和IRE1α的患者的总体存活率明显短于低表达水平的患者。（Figure2） 3. ER应激与HCC患者的PD-L1表达有关 表达较高水平的GRP78（GRP78 high）的肿瘤组织在基质中具有大量CD68染色，而在表达低水平GRP78（GRP78 low）的肿瘤组织中CD68 +巨噬细胞浸润低得多。定量分析显示GRP78 high肿瘤基质中的CD68 +区域显著高于GRP78 low基质中的CD68 +区域，有相关报道表示，PD-L1抑制T细胞活化并导致肿瘤免疫逃逸。免疫组织化学分析发现GRP78 high肿瘤中PD -L1分布水平明显高于GRP78 low肿瘤。此外，qPCR和蛋白质印迹分析显示，与癌旁组织相比，PD-L1 mRNA和蛋白在肿瘤组织中显著上调。免疫荧光双染色，发现GRP78 high HCC肿瘤基质中，PD-L1常与CD68 +巨噬细胞共定位。Kaplan-Meier分析显示，低表达PD-L1的患者存活时间长于高表达PD-L1的患者。（Figure3） 4. 在体外，ER应激的HCC细胞的外泌体上调巨噬细胞PD-L1的表达 前面结果表明高ER应激状态与HCC患者巨噬细胞中PD-L1表达上调有关，提示ER应激HCC可能促进巨噬细胞中PD-L1的表达。外泌体是不同细胞类型之间的重要通信者，作者假设ER应激的HCC细胞可以释放外泌体并随后上调巨噬细胞PD-L1的表达。在体外，将巨噬细胞分别与HepG2衍生的Exo-con（未处理的HCC细胞外泌体）和Exo-TM（衣霉素处理的HCC细胞外泌体）共孵育，之后做免疫组化、蛋白质印迹和qPCR检测，结果显示，Exo-TM增加巨噬细胞中PD-L1的表达。（Figure4） 5. 在体内，Exo-TM上调巨噬细胞中PD-L1的表达 为了确定Exo-TM是否也能增强体内PD-L1的表达。通过小鼠尾静脉静脉注射PKH67标记的外泌体，之后对组织进行PD-L1表达水平的检测（qPCR、免疫组化、蛋白印迹），结果显示， Exo-TM在体内上调PD-L1的表达。（Figure5） 6. Exo-TM处理巨噬细胞降低了CD8 + T细胞比率并促进T细胞凋亡 有相关报道表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞浸润通过损害CD8 + T细胞的免疫应答来促进肿瘤进展。作者猜想ER应激的HCC细胞是否也是通过损害CD8 + T细胞的免疫应答来促进HCC进展。为了验证这一假设，作者用流式细胞术检测Exo-TM处理的巨噬细胞对T细胞的影响。结果显示，与Exo-con处理的巨噬细胞相比，Exo-TM处理的巨噬细胞显著降低了CD8 + T细胞比例。此外，使用凋亡检测试剂盒检测T细胞凋亡，发现与Exo-TM处理的巨噬细胞孵育后凋亡T细胞的比例显著高于Exo-con处理的巨噬细胞。（Figure6） 7. ER应激的HCC来源的外泌体含有高水平的miR-23a-3p，通过调节PTEN/AKT通路上调巨噬细胞中PD-L1的表达 为了确定ER应激的肝癌细胞是否通过外泌体向巨噬细胞传递特异性miRNA并影响其免疫功能，作者对外泌体进行了高通量测序分析。生物信息学分析结果显示，miR-29a-3p，miR-23a-3p，miR-486-3p和miR-486-5p被预测通过PTEN-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）调节PD-L1表达，qPCR分析结果显示miR-23a-3p在Exo-TM中具有最高的倍数增长。用microRNA数据库预测发现PTEN是miR-23a-3p的一个假定目标，并通过双荧光素酶报告基因分析和蛋白质印迹得到证实。有研究报道PTEN可调节PD-L1的表达，用miR-23a-3p mimics处理mTHP-1细胞进行相关指标的检测。结果显示， miR-23a-3p上调巨噬细胞中的PD-L1表达。（Figure7） 8. 为了进一步证实miR-23a-3p是否通过激活PTEN / AKT途径调节PD-L1表达，作者首先将巨噬细胞与Exo-TM或Exo-con共培养，发现与Exo-con相比，Exo- TM显著下调PTEN并上调p-AKT。此外，qPCR分析证明，与Exo-con相比，Exo-TM显著增加了共孵育的巨噬细胞中miR-23a-3p的表达。用miR-23a-3p inhibitor转染巨噬细胞消除了Exo-TM介导的PTEN下调和p-AKT上调。之后，作者对PTEN进行敲低，发现PTEN的敲低显著上调巨噬细胞中PD-L1蛋白表达。以上结果表明，Exo-TM通过抑制PTEN和随后的AKT途径激活上调巨噬细胞中PD-L1的表达。（Figure8） 结论：结果表明，HCC细胞可以通过外泌体向浸润的巨噬细胞传递ER应激信号miR-23a-3p分子（miR-23a-PTEN-AKT途径），进而促进肿瘤的发生。 |
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