NGS专题 | 二代测序服务——LncRNA-Seq

长链非编码RNA(long coding RNA，lncRNA)是一类转录本水平超过200nt、不编码蛋白的RNA。LncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具备生物学功能。然而，近几年的研究表明lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达、参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有密切联系。

     现阶段，利用高通量测序技术进行lncRNA测序，并结合生物信息学的预测工具进行lncRNA分析，有助于科研工作者更快发现那些具有重要调控功能的lncRNA，分析其与特定生物学过程的关系。该方法可以更加高效地获取lncRNA序列以及位置信息，且突破了常规lncRNA芯片检测技术的使用范围限制，还可对新的lncRNA进行预测及功能分析，极大促进lncRNA的深入研究。

中康博技术优势

● 技术重复性高：同一样本重复建库相关性Pearson值大于0.993
● 高特异性：使用特定方法降低样本中rRNA的丰度
● 高准确度：构建链特异性转录组文库，快速、高效、准确地获取样本中几乎全部的lncRNA序列及其位置信息
● 分析严格：系统鉴定已知lncRNA，设置严格的筛选条件用于发现新的lncRNA
● lncRNA深入分析：lncRNA cis和trans调控机制以及ceRNA调控机制等
● 经验丰富：已对多种动植物的lncRNA进行测序分析

推荐测序模式

● 测序平台：Hiseq X 10/Nova seq
● 测序类型：PE150
● 测序数据量：10 G/样本

lncRNA测序实验流程

lncRNA测序分析流程

样品要求（RNA）

1) 样品纯度：OD 260/280值应在1.9～2.2 之间。
2) 样品浓度：最低浓度不低于100ng/ul。
3) 样品总量：每个样品总量不少于2µg。
4) 样品溶剂：总RNA溶解于DEPC-水或者RNase-free的缓冲液中。
5) 样品运输： RNA用冻存管保存，并用干冰或液氮运输。

lncRNA测序结果展示

一、标准分析：

1) 原始数据预处理：去除接头污染、低质量序列得到clean data，去除核糖体RNA数据，数据产出统计及测序数据质量评估。
2) 序列拼接比对：比对分析、数据拼接为后续做准备；基因组mapping，转录本组装。
3) lncRNA筛选及注释：已知lncRNA（采用NONCODE、lncrnadb、Ensembl、NCBI、UCSC等多个lncRNA数据库的集合或者自定义数据库筛选并注释已知lncRNA；）；多种算法（PhyloCSF预测算法与CPC预测算法）预测新的lncRNA。
4) lncRNA定量及差异分析：差异分析需2个或2个样品以上。
5) 差异lncRNA靶基因预测：通过共表达或者位置关系分析lncRNA的靶基因。
6) 差异转录本分析：利用软件比较各转录本在不同样本间的差异表达，筛选差异转录本。
7) 结构分析：AS/SNP/InDdel分析，分析转录本结构变化。
8) 功能通路富集分析：差异lncRNA靶基因的GO analysis；差异lncRNA靶基因的pathway analysis。

二、高级数据分析

● Gene Expression Trend Analysis (时序分析)

   对于按照处理时间、浓度、疾病恶化程度顺序设计的序列实验，为了筛选出随样本顺序变化影响最显著、最主流的lncRNA群，需要对样品的差异lncRNA进行表达趋势分析。应用模糊聚类等机器学习方法，计算出随着时间、浓度梯度或恶性程度等变化过程中lncRNA的表达趋势，得到相应的主流表达趋势，其所属lncRNA的表达变化与时间、浓度、恶性程度具有显著性联系的lncRNA，主流表达趋势所属lncRNA将作为进一步研究的目标基因。

 ● Co expression Network(lncRNA-mRNA)

    Co expression Network是分析lncRNA与mRNA相互作用关系的创新工具。Coexpression Network根据lncRNA及mRNA的实测值，通过共表达计算方法构建网络。通过lncRNA周边与其共表达的mRNA来预测未知lncRNA的功能。Coexpression Network可以帮助发现lncRNA与mRNA之间可能存在的作用关系，能够找到影响mRNA表达的lncRNA，从而发现网络中起中心调控作用的lncRNA及发现lncRNA可能存在的新作用机制。由于共表达调控网络是基于芯片的实测表达值运算的结果，故而突破了传统分析中基因注释不齐全的限制，大大增加了研究的创新性。结果样式如下：

● lncRNA Target Pathway Network

       根据差异lncRNA和被调控靶基因的显著性通路，利用lncRNA和靶基因通路的属性，构建lncRNA Target Pathway Network。该网络反映目标lncRNA对Pathway的作用关系。根据网络中各lncRNA的位置函数计算出网络特征值。特征值最高的lncRNA处于网络的枢纽性地位，该lncRNA对多个Pathway和样本状态有重要的调控价值，同时，评价Pathway在网络中的特征值，可以发现差异lncRNA所调控的核心通路。

● ceRNA Network

     分别对miRNA与mRNA、miRNA与lncRNA进行靶向预测，并根据表达趋势取负相关。根据结果找出具有mRNA-miRNA-lncRNA关系的mRNA/lncRNA对。计算差异基因和差异lncRNA间的共表达关系，挑选出互为正相关的基因与lncRNA。根据上述分析结果，选出存在于mRNA-miRNA-lncRNA关系中，并互为正相关的mRNA/lncRNA对。这对mRNA/lncRNA即可能互为ceRNA，再通过MREs的数量和结合分值评估ceRNA的竞争能力。结果样式如下：

样品总量：每个样品RNA总量不少于1μg 。
样品运输： RNA样本-80度冻存；在运输过程中请将管口密封好，以防出现污染。

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