来源：石头道科普
蛋白质是生命功能的最终执行者，也是临床诊断、疾病分型、药物筛选等生物医学相关领域重要、应用广的检测对象。免疫检测一直以来在蛋白质检测中占据着主导地位。免疫检测技术如ELISA，CLIA等的灵敏度一般只能达到pg/mL水平。然而，在疾病早期，精确检测这些超低丰度蛋白又对预判疾病的发生与转归有着重大意义，伴随着大健康产业和精准医学的发展，传统方法的技术瓶颈与巨大市场需求之间的矛盾日趋凸显。本期推送主要介绍Digital ELISA的技术原理及产业化情况。
Digital PCR是目前绝对定量PCR的主要技术方式，通过对样品的微滴化处理，使每个单元包含没有、一个或者多个拷贝的目标分子，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。由于不需要对其扩增曲线进行监控，不受扩增效率影响，扩增结束后通过直接计数或泊松分布公式来计算每个反应单元的平均浓度达到绝对定量的目的。
同样的理念目前已用于开发其它数字化检测技术，如Digital ELISA、Digital LAMP和Digital RPA。为了实现更低浓度蛋白质检测，Quanterix采用类似于Digital PCR的方式开发了Digital ELISA。它们称这个技术为Simoa（Single-molecule Array），Simoa技术灵敏度比ELISA高1000倍以上，它的出现将蛋白质检测技术直接带入到单分子、数字化检测时代，成为fg级超低丰度蛋白质检测领域的优势技术。
什么是Digital ELISA
Digital ELISA，也称为Simoa技术，与传统免疫试验主要区别在于Simoa能够在飞升大小的孔中捕获单个分子，允许单个磁珠信号的数字化读取。Simoa最早的报道源自于2010年naure biotechnology的报道。本质上SIMOA的设计理念和Digital PCR很像。
Simoa所采用的Digital ELISA基本原理和Digital PCR类似。为了检测血液中的低丰度蛋白质，Simoa用特异性抗体修饰的微珠捕获靶标生物标志物，在生物标志物浓度很少时，每个珠子能捕获一个或零个靶蛋白质分子，通过免疫反应后形成免疫复合物，然后用能够产生荧光产物的酶报告信号。通过把单个珠子限定在50 fL反应室中，使用荧光成像来检测单个格子的荧光信号进行最后定量。这种单分子酶联免疫吸附试验（Digital ELISA）方法具有在100 μL样品中检测到少至约 10-20个酶标记的复合物。
Digital ELISA的检测步骤
Simoa的检测步骤可分为捕获、封装、成像三步（Loading, sealing, and imaging）。
磁微粒免疫捕获
使用直径为2.7微米的磁珠标记特异性抗体。通常而言，一个磁珠上有大约250000个识别位点，保证了识别的效率。将含有500000个标记磁珠加入到100微升样本中，保证每个磁珠尽可能的只捕获到一个生物标志物，并尽可能的把所有标志物都捕获到。余下步骤和普通的磁微粒酶触化学发光类似，经过清洗和偶联酶联抗体形成最后的磁微粒免疫复合物。
磁微粒的阵列封装
Simoa使用蝶式芯片的方式将磁微粒进行分装并利用超灵敏荧光探针对荧光信号进行检测。这两部分属于Quanterix的核心技术。纯化后的磁微粒免疫复合物被加入到芯片表面微孔反应室中，由于每个微孔的尺寸（4.25微米宽，3.25微米深）只能容下一个微球，并且被硅油封闭，使得可以使用直接计数或泊松分布公式得到生物标志物的含量。
Simoa的蝶式芯片具有24路检测通道，每个通道都含有216000个微孔阵列。通常而言，微孔的数量越多，制造难度和成本也越大，这部分应该也属于Quanterix的核心技术。
荧光成像和蛋白定量
图像的获取是通过CCD进行成像。通过软件控制CCD进行长时间曝光获得明场和荧光照片，从两幅照片中获得荧光点占总颗粒的百分比进而确定生物标志物浓度。对于更高浓度的生物标志物，还可以利用CCD采集模拟信号值进行检测，这种方法大大扩大了其检测动态范围。
QUANTERIX简介
2007年，Walt成立了Quanterix Corporation。公司总部位于美国马萨诸塞州，规模很小，只有数十名员工。不过，Quanterix自主研发的单分子免疫阵列技术（SiMoA）是目前商业化产品中最灵敏的免疫分析方法，还已经具备多重检测能力。
Quanterix公司一直致力于数字化的蛋白标志物研究，推动精准医疗发展。其核心技术是 simoa (single molecular array)，即单分子阵列技术，科学创始人之一是美国工程院和医学院院士David R. Walt教授（illumina创始人之一）。2017年12月在美国纳斯达克上市(nasdaq: qtrx)。
Quanterix推出的仪器都是基于simoa技术，simoa可实现单个分子检测，灵敏度达到飞克级别（fg/ml），比传统elisa方法灵敏度高出1000 倍。应用于肿瘤，神经、心血管、感染性疾病和免疫炎症等领域蛋白标志物检测，以及mirna检测。
Walt博士不仅是Quanterix科学顾问委员会的科学创始人和主席，其也是基因测序龙头企业Illumina的创始人兼董事。他是塔夫茨大学的罗宾逊化学教授和霍华德休斯医学研究所的教授。Walt博士是美国国家工程院院士，美国科学促进会成员，美国医学和生物工程研究所研究员。Walt博士是多个期刊的编辑顾问委员会成员，包括分析化学，分析和生物分析化学，传感器快报和印度生物技术杂志。
产业化情况
目前Quanterix有多种通量的仪器以满足不同的应用需求，其中最出名的是Simoa HD-1。具体检测性能和仪器参数如下所示。
检测性能
参数 | Simoa HD-1 |
灵敏度 | 比现有的常规免疫检测平均高1000倍以上 |
动态范围 | >4 logs |
精准度 | <10% CVs |
仪器参数
参数 | Simoa HD-1 |
通量 | 68个检测／小时 >500个数据点／天 |
工作流程 | 批处理（96孔板或样本管） |
总检测时间 | <2.5小时／96孔板 |
手工操作时间 | 准备时间<20分钟 |
自动化 | 全自动（从样本进入到数据产出） |
上样 | 96孔板或样本管 |
上样体积 | 1ml*-100ml |
仪器空间 | 135×60×160cm，落地式 |
多重分析能力 | 一个样本10重检测 |
目前Simoa的商品化试剂盒已经覆盖肿瘤、神经、心血管、免疫等。通过Simoa可以直接对血清和血浆中蛋白、miRNA等标志物进行超高灵敏度检测，极大的推动肿瘤、神经、感染性疾病和免疫炎症，特别是癌症的早期检测，术后的检测和精准用药。国内杭州纽蓝科技有限公司是Quanterix中国区总代理。2018年，佰美基因和Quanterix合作成立佰美-Quanterix中国合作研究中心。
具体的检测项目如下所示
