李红教授团队揭示长链非编码RNA在胰岛素抵抗中的作用和机制 | EASD中国之声

2型糖尿病、代谢综合征等肥胖相关的代谢性疾病是威胁人类健康的重大公共卫生问题。胰岛素抵抗(Insulin Resistance)是肥胖、糖尿病以及高血压等发生发展的病理生理基础，且胰岛素抵抗的发生早于肥胖、糖尿病以及高血压等，但是胰岛素抵抗的标准检测方法繁琐，费时费力费钱，不适于临床开展。肥胖及肥胖诱发的2型糖尿病、代谢综合征、心血管疾病等代谢性疾病给全世界带来了沉重的社会负担和经济负担。因此，实现胰岛素抵抗早期指标的筛查临床意义重大，但是目前胰岛素抵抗临床检测和早期筛查困难，尚且没有适宜的新技术。

LncRNAs（Long non-coding RNAs）是一类长度大于200个核苷酸序列且不编码功能性蛋白的内源性RNA（目前已有少量研究证实lncRNAs也可编码一些功能性的短肽）。已有诸多研究显示不同水平lncRNAs可在内分泌及代谢过程中发挥重要作用，不仅参与糖脂代谢的调控，而且影响内分泌腺相关肿瘤的形成及某些腺体正常功能的发挥，但是其中的具体机制并不十分清楚。因此，阐明lncRNAs在内分泌及代谢中的具体调控机制对于相关代谢性疾病的诊治具有重要临床价值。

浙江大学医学院李红教授团队发现新型临床分子标记物lncRNAs的表达变化与胰岛素抵抗密切相关，该团队在前期工作中寻找肥胖相关代谢性疾病患者中致病及易感基因筛查的时候发现了一系列lncRNAs的显著性差异表达。他们在高脂饮食喂养诱导的DIO肥胖模型小鼠血清中通过lncRNA-seq方法筛选了一系列胰岛素抵抗相关的lncRNAs，并在社区代谢综合征扩大人群样本中进行了qRT-PCR表达验证，筛选出其中表达差异最为显著的3个lncRNAs：Blnc1（Brown fat lncRNA 1）、H19和PVT1 （Plasmacytoma Variant Translocation 1），发现Blnc1和H19等lncRNsA在肥胖小鼠各胰岛素靶器官组织中表达显著降低，而PVT1的表达显著升高。统计学分析显示它们的表达水平与胰岛素抵抗指标HOMA-IR显著相关，是胰岛素抵抗、肥胖以及代谢综合征的独立危险因素。随后根据这3个候选lncRNAs在胰岛素作用靶器官的不同表达模式，分别在脂肪组织、肌肉组织和肝脏组织对它们进行了功能学实验验证和分子机制探讨。在本次EASD大会上，李红教授团队关于这三个lncRNAs的相关研究均入选大会口头发言，另外两项相关研究入选大会壁报交流，是本次EASD大会入选研究内容校多的研究团队之一。

PVT1通过结合RNA结合蛋白PTBP1调控转录因子FoxO1在胰岛素抵抗中的作用与分子机制

该研究通过在高脂饮食喂养的肥胖胰岛素抵抗模型DIO小鼠附睾脂肪组织定点注射PVT1过表达腺病毒的方法成功在附睾脂肪组织中特异性过表达PVT1，并通过腹腔注射葡萄糖耐量实验（IPGTT）及胰岛素耐量实验（ITT）发现附睾脂肪组织特异性过表达PVT1会显著促进肥胖小鼠的胰岛素抵抗状态，增加了小鼠脂肪和肝脏的脂质沉积，损伤小鼠的肝脏功能，且增加小鼠附睾脂肪的重量，但小鼠体重改变尚无统计学上的差异。之后，又使用了db/db肥胖模型小鼠及其对照db/m小鼠，利用PVT1 shRNA敲低慢病毒进行尾静脉注射的方法成功敲低了PVT1的全身性表达水平，继续通过口服葡萄糖耐量实验（OGTT）及ITT实验发现尾静脉注射敲低PVT1后可以有效改善db/db肥胖小鼠的胰岛素抵抗状态，显著减轻小鼠肝脏和骨骼肌的脂肪沉积，有效缓解肝脏功能损伤及糖脂代谢异常，小鼠肝脏重量显著减轻，总体重、附睾脂肪组织及腹股沟脂肪组织重量均有不同程度下降，但改变尚无统计学上的差异。随后，取PVT1过表达腺病毒注射的DIO小鼠及PVT1慢病毒敲低尾静脉注射的db/db小鼠的肝脏组织和它们相应的对照肝组织，检测了经典胰岛素信号传导通路及糖脂代谢基因Marker的表达差异谱，发现过表达PVT1显著增加关键转录因子FoxO1的转录活性，进而调节其下游代谢关键Marker基因如PEPCK、G6Pase、GcK和Glut4等的表达（既有正向促进表达，也有反向抑制表达）。敲低PVT1后则抑制FoxO1的表达，影响相应下游基因转录。同时，敲低PVT1还能激活经典胰岛素信号通路PI3K-Akt，Akt磷酸化激活后调控FoxO1出核及定位，从而也影响了FoxO1的转录。以上结果提示PVT1影响胰岛素抵抗效应可能是通过激活FoxO1的转录活性，调节其下游靶基因表达，并且抑制PI3K-Akt胰岛素信号转导调节FoxO1入核及定位引起的。根据之前研究，研究团队又利用PVT1生物素探针进行了Biotin-RNA pull-down实验，进一步通过质谱检测和蛋白质定性分析鉴定与PVT1相互结合的蛋白,再结合starBaseV3数据库中RBP-RNA结合的CLIP-seq数据，最终发现了数条与PVT1结合的RNA结合蛋白，如PTBP1、hnRNP A1、hnRNP K、IGFBP2和U2AF2等，最后用Western Blot实验验证了PVT1与PTBP1蛋白相互结合。

结合目前有关PVT1的研究报道和团队的一系列前期功能学实验结果，该研究提出以下科学假设：在肥胖或者肥胖相关的2型糖尿病、代谢综合征等患者中敲低PVT1后可以有效改善其胰岛素抵抗状态，该作用是通过改善肝脏、肌肉等组织脂肪异位沉积，促进糖脂代谢功能及线粒体能量代谢实现的。其分子机制可能是PVT1可以激活糖脂代谢关键的转录因子FoxO1，促进其下游靶基因转录，影响PEPCK、G6Pase、GcK和Glut4等基因的表达。同时抑制经典胰岛素信号通路PI3K-Akt，影响FoxO1的出核及定位。另外，PTBP1通过结合PVT1参与调控转录因子FoxO1的转录活性。

林细华博士在EASD大会进行口头报告

林细华博士

林细华博士简介

医学博士，硕士生导师，毕业于北京协和医学院/中国医学科学院生物化学与分子生物学系，现为浙江大学医学院附属邵逸夫医院内分泌科助理研究员。参加工作至今，一直致力于肥胖相关代谢性疾病发病原因及分子机制的研究，并从基因表达调控、代谢组学、表观遗传与修饰、信号传导通路等分子生物学途径去进一步寻找有效简易的分子生物标记物以及探索2型糖尿病及肥胖等代谢性疾病的发病机制和治疗方法。近5年以第一作者发表SCI论文五篇，主持国家自然科学基金青年基金一项，主持省部级和卫健委基金三项，并以主要参与人身份参与多项国家自然基金面上项目等。

Blnc1通过重塑白色脂肪中的线粒体功能来改善肥胖引起的胰岛素抵抗的机制

长链非编码RNA-Blnc1在棕色及米色脂肪的分化中发挥着必不可少的调节作用。越来越多的证据表明白色脂肪组织（WATs）的线粒体功能障碍与全身代谢异常的发生发展密切相关。然而，lncRNA在WATs线粒体中的作用还是知之甚少。本研究的目的是探讨lncRNA-Blnc1与WATs线粒体功能的关系以及在全身代谢稳态调节中的作用。

该研究采用了高脂饮食喂养12周建立的小鼠肥胖模型，单侧附睾脂肪多点注射lncRNA-Blnc1过表达腺病毒。处理5周后，采用IPGTT和ITT检测机体的葡萄糖耐受和胰岛素敏感性。分离小鼠的附睾脂肪及肝脏组织，利用H&E染色观察组织结构及脂质积累情况；检测不同处理组小鼠的附睾脂肪组织的线粒体生物合成和功能。在体外研究中，在过表达以及敲低Blnc1的3T3-L1前脂肪细胞系中观察线粒体的生物合成和功能变化。在机制层面上，采用RNA-pull down结合质谱和RIP技术寻找Blnc1结合的蛋白及下游靶基因。

研究发现与对照组肥胖小鼠组相比，注射Ad-Blnc1腺病毒组的肥胖小鼠，附睾脂肪中Blnc1的表达明显上调，而肝脏组织中的Blnc1表达降低。过表达Blnc1组肥胖小鼠的肝脏组织中的脂滴沉积和甘油三酯含量降低。此外，肥胖小鼠过表达Blnc1后，葡萄糖耐量和胰岛素抵抗得到显著改善。通过mtDNA拷贝数检测和mito-tracker染色，观察到肥胖小鼠过表达Blnc1后，附睾脂肪中的线粒体生物合成显著增加；且线粒体合成和功能相关基因（Pgc1α，NRF1，Adiponectin，电子传递链复合物）的表达明显上调；在肝脏组织中，参与脂肪酸氧化的基因（Acadl，Acox1，PPARα）的表达升高。在体外研究中，过表达Blnc1的3T3-L1前脂肪细胞中的线粒体生物合成和功能显著增加；而敲低Blnc1后，前脂肪细胞的线粒体合成和功能部分受损。通过RNA-pull down和质谱实验，筛选得到一些与Blnc1结合的候选RNA结合蛋白，如hnRNPA1，hnRNPU和PTBP1，且采用RIP技术确定了Blnc1和hnRNPA1的相互结合。

由此可见在肥胖小鼠附睾脂肪中特异性过表达Blnc1能够有效减少肝脏中的脂质积累和改善全身胰岛素敏感性，这些作用可能与Blnc1改善附睾脂肪中的线粒体生物合成和功能密切相关。

唐圣洁博士在EASD大会上做了口头报告

唐圣洁博士

唐圣洁博士个人简介

浙江大学医学院2015级直博生。博士阶段的主要研究为lncRNA与肥胖相关代谢疾病的关系与分子机制的研究。发表SCI论文3篇，以壁报或者口头发言形式参加了多个国内外会议并获浙江省内分泌年会优秀壁报；2018年参与马来西亚IDF-WPR壁报展示。以主要参与人身份参与多项国家自然基金面上项目和多个省级和卫生厅科研项目等。

长链非编码RNA-H19在肥胖小鼠骨骼肌脂质代谢及胰岛素抵抗中的作用及其潜在机制

该研究选取db/db及其对照db/m小鼠骨骼肌样本，利用qPCR检测肥胖及正常小鼠骨骼肌中H19表达情况。db/db小鼠尾静脉注射H19过表达腺病毒载体后，检测小鼠体重、空腹血糖、胰岛素水平、血清甘油三酯，骨骼肌甘油三酯含量等，行OGTT和骨骼肌组织油红O染色以评估H19对肥胖小鼠骨骼肌糖脂代谢的影响。在分离并培养原代肌卫星细胞细胞，采用H19过表达腺病毒感染及H19 siRNA转染细胞，油红O染色检测H19对骨骼肌细胞脂质沉积的影响；进行电镜、seahorse海马能量检测、线粒体染色等观察H19对骨骼肌细胞线粒体形态及功能的影响。并利用RNA pull down和RIP进一步探究与H19相互作用的蛋白，结合western blot和qPCR检测其下游脂质代谢相关基因（PGC1α、CPT1b、CD36）蛋白和mRNA的变化。该研究发现肥胖小鼠骨骼肌中的H19表达低于正常对照小鼠（P<0.01）。与对照组小鼠相比，H19过表达组小鼠葡萄糖不耐受症状有所改善，空腹血清胰岛素、糖化血清蛋白水平降低（P<0.05），但小鼠体重及空腹血糖在两组间没有明显改变。H19过表达组小鼠骨骼肌甘油三酯含量较对照组降低，油红O染色和HE染色显示肌肉间脂质含量也降低。过表达H19的骨骼肌细胞系及原代肌卫星细胞的线粒体形态得到改善，同时线粒体氧化磷酸化和ATP产生增加，敲低H19则反之。RNA pull down结合质谱结果显示H19可与核内不均一核糖核蛋白hnRNPA1结合，RIP结果也证实hnRNPA1可与H19结合，同时还可结合PGC1α、CD36。且H19过表达的骨骼肌细胞中PGC1α、CPT1b、CD36的蛋白及mRNA水平增加，敲低反之。

由此可见H19可减少肥胖小鼠骨骼肌组织脂质过度堆积从而改善机体的胰岛素抵抗和糖耐量异常；该作用机制可能是H19招募hnRNPA1蛋白促进下游基因PGC1α、CPT1b等表达水平，从而增加骨骼肌细胞中线粒体能量代谢。

桂薇薇博士在EASD大会进行口头报告

桂薇薇博士

桂薇薇博士个人简介

浙江大学医学院2016级直博生。博士阶段的主要研究为lncRNA与肥胖、胰岛素抵抗相关代谢疾病的关系与分子机制的研究。发表SCI论文3篇，多次参与国际国内内分泌相关会议，并获浙江省内分泌年会口头交流第一名。以主要参与人身份参与多项国家自然基金面上项目和多个省级和卫生厅科研项目等。

此外，该研究团队还介绍了环状非编码RNA-circH19在胰岛素抵抗和脂质代谢中的作用及其潜在机制。该研究结果由李红教授团队林细华博士在EASD大会中进行了壁报展示和汇报交流。该研究结果发现H19的体内转录可以有效成环——circRNA-H19，circRNA-H19在代谢综合征患者血清样本中表达异常升高且与脂质代谢相关指标正相关。敲低circRNA-H19促进脂肪干细胞成脂分化以及脂质沉积，潜在的机制可能与circRNA-H19的下调解除了对PTBP1的结合抑制作用，激活SREBP1的核内转位，从而促进了下游脂质分化相关基因的表达有关。

林细华博士EASD大会壁报交流

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另外一项由李红教授团队张子亦博士主导的关于肝X受体激动剂对糖尿病小鼠肾脏的影响及其相关机制的研究也入选了EASD大会壁报交流，并由桂薇薇博士进行现场汇报交流。

该研究旨在阐明LXR激动剂对糖尿病小鼠肾脏的作用，并探讨LXR激动剂对足细胞自噬功能的影响及其相关分子机制。

将C57BL/6J小鼠随机分为三组：对照组（NC）、糖尿病模型组（DM）和糖尿病+TO901317处理组（DM+TO901317），采用STZ建立1型糖尿病小鼠模型，并采用病理染色和免疫组化观察TO901317对小鼠肾脏的影响。体外构建足细胞系，采用Western blot、RT-PCR、siRNA、免疫荧光等技术探讨LXR激动剂对足细胞自噬功能的影响及其分子机制。

1. LXR激动剂对糖尿病小鼠肾脏病理改变、肾功能及肾脏组织自噬作用的研究。（1）DM组小鼠较NC组体重明显下降，血糖、肾重/体重比、血清肌酐及24小时尿白蛋白排泄量（24h UAE）明显增加（P<0.01），肾小球系膜增生、基底膜增厚及纤维化程度加重，并出现足细胞足突融合、脱落。DM+TO901317组小鼠较DM组血糖、血清肌酐、肾重明显下降（P<0.05），肾脏病理改善，但足细胞足突融合、脱落程度反而加重，小鼠体重、肾重/体重比及24h UAE两组间无显著性差异。（2）DM组小鼠肾脏组织中p62的表达水平明显高于NC组，TO901317可进一步升高其表达水平（P<0.01）。（3）DM组小鼠肾小球中足细胞标志蛋白表达较NC组明显下降，TO901317可进一步降低其表达水平（P<0.01）。

2. LXR激动剂对足细胞自噬的影响及其机制研究。（1）LXR激动剂TO901317和GW3965可通过抑制自噬体的生成来抑制足细胞自噬，使LC3B-II及Beclin1表达显著减少，p62表达显著增加（P<0.01）。（2）LXR激动剂可明显抑制足细胞标志蛋白的表达（P<0.01）。（3）利用siRNA敲低足细胞中LXRβ的表达后，足细胞中LC3B-II的表达增加。（4）LXR激动剂可使p-mTOR表达显著增加，p-AMPK和SIRT1表达显著下降（P<0.01），而mTOR抑制剂雷帕霉素可部分逆转LXR激动剂对足细胞自噬的抑制作用，增加LC3B-II和足细胞标志蛋白的表达水平。

由该研究可以看出TO901317可以降低糖尿病小鼠血糖和血清肌酐水平，改善肾脏病理改变，但并未降低24h UAE。TO901317还可降低肾脏组织自噬水平，加重足细胞损伤。LXR激动剂可通过抑制自噬体形成抑制足细胞自噬活性并损伤足细胞，这种作用可能是通过影响mTOR、AMPK和SIRT1信号通路产生的。

桂薇薇博士EASD大会壁报交流

李红教授研究团队简介

本研究团队所在单位邵逸夫医院内分泌科，系浙江大学医学部重点建设学科、浙江省医学创新学科，浙江大学唯一的内分泌代谢病学科博士学位点，卫生部内分泌代谢病学专科住院医师培训基地。本学科主要研究方向为代谢综合征、糖尿病及糖尿病慢性并发症的基础和临床研究，在糖尿病肾病的早期诊断和治疗、2型糖尿病发病机制、代谢综合征的基础和临床研究、糖尿病社区管理等方面有长期的积累。近5年承担国家自然科学基金、十一五、十二五国家科技支撑计划项目子课题、浙江省重大科技专项、浙江省自然科学基金、浙江省卫计委、浙江省教育厅等基金资助课题60余项（其中国家级课题12项），发表论文100余篇，其中SCI收录论文80余篇。多项科研成果获省政府、省卫生厅或省教育厅科技奖。本团队医生共27名，其中博士学位17人，正高6人，副高6人，博导3名，硕导6名，及其专职科研助手2名，医技人员3名，研究人员的组成上由具备较强科研能力的助理研究员、博士后、博士和研究生担当课题的主要负责,及多年从事分子生物学、病理学及免疫学的技术人员组成，长期从事肥胖及胰岛素抵抗相关疾病的临床与基础研究，具有扎实的理论基础和娴熟的实验室技术。且科室所在单位还拥有大型的中心实验室及浙江省生物治疗重点实验室（为浙江省重点实验室），生物电磁学实验室及国家部级重点实验室。

该研究团队一直致力于肥胖相关2型糖尿病及代谢综合征的发病机制研究，近年来在肥胖及糖尿病的基础和临床研究方面取得了很好的成效。目前已建立大型的基于社区2型糖尿病及代谢综合征患者的临床资料数据库，在浙江省选择具有代表性的地区和人群，建立了1000多人社区代谢综合征研究队列，建立了浙江地区成人体脂分布数据库和样本库，发现血清Lipoxin A4、fractalkine、尿酸等指标与代谢综合征密切相关，睡眠时间过短等不良生活方式与糖尿病密切相关，同时开展针对糖尿病肾病的社区管理的规范化研究，制定社区糖尿病肾病管理的诊断与防治标准化流程，构建糖尿病及糖尿病肾病综合信息平台，并在上海市第六人民医院等6家单位推广应用，有专人定期跟踪随访患者的生活方式调查、治疗、预后、生存等数据，提高了糖尿病肾病的检出率及糖尿病综合控制达标率，取得了较好的社会效益。本课题组近年来着重于肥胖相关2型糖尿病及代谢综合征胰岛素抵抗的功能和分子机制研究，已取得一系列研究成果，积累了丰富经验，具有良好的研究工作基础。

李红教授团队2019年EASD参会代表

（来源：《国际糖尿病》编辑部）