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2019年可谓是RNA m6A修饰研究大爆发的一年，无论是从国自然中标项目（链接：2019国自然最全m6A RNA甲基化解析），还是文章发表情况（链接：m6A领域热点与热点相结合）。植物研究领域更是如此，8月6日刚刚在Genome Biology上发表了《RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening》的研究论文，发现了DNA甲基化可通过调节m6A去甲基化酶基因表达的方式影响番茄果实m6A修饰，而m6A去甲基化酶反馈调节DNA甲基化，从而共同调控果实成熟。紧接着8月13日，题为《Evolution of the RNA N6-methyladenosine methylome mediated by genomic duplication》的论文又成功登上植物老牌顶级期刊Plant Physiology。今天小编就和大家一同分享下这篇文章。 
RNA N6-甲基腺苷(m6A)修饰是真核生物中最丰富的RNA表观遗传修饰形式。研究者假设m6A进化部分与复杂多倍体植物基因组中的基因组复制事件（genomic duplication events）有关。为了验证这一假设，本研究展示了玉米m6A修饰图谱，并从两个亚基因组(分别为maize1和maize2)中鉴定出与11968个m6A峰，每一个都覆盖了2200多个重复基因。在这些重复基因中，携带m6A峰值的基因在保留率上表现出显著差异。m6A的这种偏向性与多个特征序列相关，并受不对称进化速率的影响。本文还描述了m6A甲基化基因和转座子的共同进化模式，它们可以通过全基因组复制和串联复制来介导。研究还发现了重复m6A功能因子的进化保守性和差异性，以及m6A修饰在玉米干旱胁迫响应中的潜在作用。本研究强调m6A修饰和基因复制之间复杂的相互作用，为理解基因组复制事件介导m6A进化的机制提供参考。材料取自玉米B73和Han21杂交株系，待植株生长到三片叶片完全展开时，液氮冻存叶片后提取RNA。叶片RNA提取采用RNAiso Plus (Code No. 9109, TaKaRa)，PolyA+ mRNA富集采用oligo (dT)25磁珠(Code No. S1419S, NEB)。RNA片段化后，与anti-m6A多克隆抗体((Synaptic Systems Cat. No. 202003)在4℃孵育2小时，然后在4℃下与protein-A beads孵育2小时，之后在0.5 mg/mL N6-甲基腺苷洗脱后用乙醇沉淀RNA。文库及测序采用Illumina平台标准化方法进行，获得50 bp单端测序数据。RNA-seq为2 x 150 PE测序数据。使用Trimmomatic v0.36工具对序列的原始读数去除衔接子序列和低质量碱基。使用FastQC检查了Trim后的RNA-seq和m6A-seq读数的质量。B73和Han21之间的SNP用GATK进行鉴定。Han21伪基因组是基于RNA-seq中鉴定的SNP构建的，参考序列为B73 (B73_RefGen_v4)。使用STAR v2.5.3a将B73和Han21 m6A-seq读序分别与玉米B73参考基因组和Han21伪基因组比对。峰值是使用“滑动窗口”方法调取的，使用R包PEA进行。为了调用m6A峰，使用25 bp滑动窗口扫描参考基因组。fisher检验用于识别富含m6A的窗口。通过使用R函数“p.adjust”，将P值矫正为错误发现率(FDR)。如果标准化读序计数的倍数变化大于2，并且FDR值小于0.05，则为显著的窗口。相邻的重要窗口合并在一起形成峰值区域。长度小于100-nt的峰从分析中排除。在三个重复中的至少两个重复中重叠的峰被合并为置信m6A峰，使用IRanges包进行。将来自四个实验处理(B73_WW、B73_DS、Han21_WW和Han21_DS)的可信m6A峰进一步合并成一组独特的m6A峰。干旱胁迫和充分灌溉条件下m6A修饰水平存在显著差异的m6A峰使用QNB软件确定，其标准为富集倍数变化≥ 2或≤ 0.5，FDR ≤ 0.05。使用topGO进行GO富集分析。本研究m6A峰的富集基序的鉴定是使用MEME和HOMER两种软件完成的。同源基因的同义(Ks)和非同义(Ka)替换分析通过SynMap、MAFFT、KaKs_calculator等软件进行。m6A功能因子编码基因的系统发育分析与鉴定使用MEGA 7软件完成。从m6A-seq数据中随机选择了两个m6A峰，分别包含UGUAU和UGUAC基序。这两个序列用作模板来合成四个RNA寡聚物。寡聚物于72℃变性3分钟。然后将样品点到Amersham Hybond-N+膜中，然后在杂交烘箱中紫外交联。交联后将膜在洗涤缓冲液中洗涤，然后在室温下用轻微摇动在封闭缓冲液中封闭。随后用anti-m6A抗体(Synaptic Systems Cat. No. 202003)过夜。将膜洗涤后用辣根过氧化物酶结合小鼠的抗兔IgG孵育。膜再次洗涤后，与ECL蛋白印迹底物在室温黑暗中孵育5分钟后显影。本研究使用EpiQuik m6A核糖核酸甲基化定量试剂盒(比色法)测定基因整体m6A水平的变化。使用m6A-IP-qPCR方法对特定m6A峰的m6A甲基化水平进行验证。RNA片段化后，与anti-m6A多克隆抗体(Synaptic Systems Cat. No. 202003)在4℃孵育2小时。乙醇沉淀后，对IP的RNA进行逆转录和qPCR分析。Cyclophilin (GenBank: M55021)用作对照，因为(1) Cyclophilin在m6A-seq数据中没有显示任何明显的m6A峰；(2) Cyclophilin在野生型和直链淀粉样品中的表达水平相对不变；(3) Cyclophilin被认为是管家基因。样品进行了3个生物复制×3个技术复制。为了获得玉米转录组范围的m6A图谱，实验构建并测序了一系列m6A免疫沉淀(IP)和匹配input(对照)文库。玉米m6A峰在3’-UTR(m6A峰的74.6%)、接近终止密码子(20.8%)和编码序列(3.2%)区域富集(图1A)。终止密码子是最富集区段，其次是3’-UTR (图1B)。在对B73和Han21 m6A-seq数据的单独分析中也观察到m6A峰的类似分布模式。在基因组水平上，11219个m6A甲基化基因(即转录本携带m6A峰的基因；缩写为m6A基因)在每条染色体上分布不均(图1D)。实验观察到11968个m6A峰中有90.6%含有玉米中的典型基序RRACH(其中R代表A/G，A是m6A，而H代表A/C/U)，此外还有检测到基序URUAY(其中Y代表C/U)(图1C)。斑点印迹试验，也验证m6A抗体对URUAY基序的特异性。
为了确定可能与m6A修饰相关的序列特征， 研究者分析了m6A基因频率和不同序列特征(基因长度、外显子长度、外显子数目、GC含量、内含子长度和基因距离)之间的皮尔逊相关系数(PCC)，使用10000次置换检验来评估PCC的统计显著性。结果观察到m6A基因的频率与外显子长度略有正相关，与基因长度和外显子数呈显著正相关，与GC含量和基因距离呈显著负相关 (图2A-D)。
由于有偏向的基因分离，两个玉米亚基因组(maize1和maize2)之间重复基因的丢失是不均衡的，因此本研究探讨了m6A修饰是否也可能与重复基因保留相关的问题。结果发现maize1中的 m6A基因的单重复率显著高于maize2中的m6A基因，这与总亚基因组基因的趋势一致，另外在m6A基因与非m6A基因比例、外显子数和基因长度上也有差异(图3A)，这些差异很可能是亚基因组偏向性分离的进化结果。此外还分析了玉米基因的非同义替换(Ka)/同义位点(Ks)的比率，结果显示m6A基因的的Ks值明显低于非m6A基因。这表明m6A基因进化速度更快，进化时间更短。
m6A甲基化和TEs的共同进化结果影响重复保留和表达差异实验还探讨了m6A修饰和玉米基因表达之间是否有关联。与m6A-seq相似，利用玉米B73和Han21幼苗的叶组织，在正常及干旱胁迫条件下进行了RNA-seq检测。结果观察到m6A基因的表达丰度明显高于非m6A基因(图4A)；m6A基因的单重复率明显低于非m6A基因，反映出m6A甲基化的复制基因的总体保留率较高(图4B)。
在对TE相关和无关的m6A基因的和非m6A基因的距离远近等的分析表明，m6A甲基化参与了与TEs的共同进化（图5）。
m6A功能因子的进化及其对低甲基化干旱胁迫响应基因表达的影响对玉米和高梁基因组分析，鉴定出多个编码m6A功能因子同源基因（图6A），对这些基因分析发现，他们具有非常类似的进化速率（图6B）。在对干旱胁迫玉米的分析后发现，在干旱胁迫敏感玉米B73品种中，ALKBH10等基因表达明显上调，同时m6A甲基化修饰水平在干旱胁迫下明显低于正常对照，表明在干旱胁迫条件下玉米的整体的m6A水平较低（图6C）。
在这项研究中，结果强调了在植物中构建转录组范围m6A图谱的重要性，并利用玉米幼苗叶片组织中m6A-seq数据揭示了与基因组复制相关的m6A修饰的进化模式。在过去几年中，人们对植物m6A的动态作用越来越感兴趣，这些调控机制是关键植物发育过程的基础，包括胚胎发育、茎干细胞命运、花发育和毛状体形态发生等。本文研究者预计，未来研究将对来自不同胁迫环境条件下、不同作物品种、不同发育阶段和组织样本，进行转录组范围的m6A图谱检测，并通过对物种内和物种间m6A修饰的比较，进一步揭示植物转录后调控的进化模式，最终从空间、时间和环境维度来阐明不同植物物种中RNA m6A甲基化的动态变化。天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验，m6A RNA甲基化作为表观领域的一大热点，天昊生物可为您提供m6A整体水平定量，结合RNA-seq和m6A MeRIP-seq挖掘潜在的受m6A调控酶影响的靶点，同时可对靶点进行MeRIP-qPCR验证。生信团队亦可提供个性化的数据库挖掘与生信分析内容。
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