干货分享—基于Orbitrap质谱的DIA和PRM定量方法设置

程汉兴

赛默飞高分辨质谱在蛋白质定量方面不仅限于传统DDA数据分析方法，还具有DIA和PRM定量方式，DIA(Data Independent Acquisition，数据非依赖采集)技术主要采用了特别的数据采集模式：

将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，然后对每个窗口中的所有离子进行检测、无差异地获得样本中所有离子的信息。

DIA和DDA定量原理不同，一般来说，DDA采用母离子定量，DIA采用碎片离子定量，DIA拥有更小的CV和更好的数据重现性，两者实际比较见图1：

图1.DDA和DIA定量方式原理示意图

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不同于DIA，PRM则是一种基于Orbitrap质谱的靶向蛋白定量方法，能够对目标蛋白肽段等，进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/肽段的定量。首先利用四极杆进行离子选择，在方法设置中输入目标肽段的母离子信息到Inclusion list；随后母离子碎裂后所有的子离子进入到Orbitrap质量分析器进行分析。详细原理见图2：

图2.PRM定量原理示意图

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DIA定量方法设置

进行DIA分析前，首先通过DDA建库进行分析，一般通过样本分级，使用PD软件构建合适规模的library，根据样品复杂程度不同，设置不同梯度，液相分析方法(以120min为例，如果是Easy1200液相和U3000Nano液相，流动相B为80%乙腈，20%水，0.1%FA)详细参数设置见表1，后续DIA色谱条件保持与DDA方法一致。

表1.DDA和DIA的液相分析方法（点击查看大图）

针对于Q Exactive系列仪器，我们建议DIA方法（以25Da窗口为例）设置参数如下图表：

表2.Q Exactive系列 DIA质谱分析方法

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DIA窗口设置列表，可为固定窗口和可变窗口，以固定窗口25Da为例，Global List里Inclusion list设置窗口如下表3所示：

表3.DIA inclusion list 设置方法（点击查看大图）

针对于Fusion系列仪器，我们建议DIA方法设置参数如下图表所示，直接拖拽full scan模块，构建experiment1，然后add experiment2，拖拽DIA模块设置，DIA窗口设置可能和QE系列仪器不一样，具体位置见下图，不同tune版本软件有所区别，窗口设置原理是一致的。

表4.Fusion 系列 DIA质谱分析方法

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DIA数据分析

小编建议可以通过PD软件结合skyline，Spectronaut等软件处理即可。

对于skyline软件

首先通过PD建库生成pdresult文件，构建library，后进行肽段和transition设置，导入DIA数据采集结果，进行FDR卡值，得到蛋白和肽段定量结果，导出报告。

对于Spectronaut软件

只需简单按教程导入library 文件和DIA文件，按照说明书参数设置分析即可。

对于EncyclopeDIA软件

首先需要通过PD生成pdresult文件，将 pdresult file 导入 skyline软件, 得到.blib文件，将 .blib 文件导入 EncyclopeDIA，得到.dlib文件，然后将.dlib文件和fasta 文件在EncyclopeDIA软件导入，选择默认参数，将质谱raw文件通过Msconvert 软件为Mzml文件导入，即自动化进行数据分析，最后保存定量报告。

针对于大规模大队列样本分析，DIA具有高覆盖度、高重现性和高准确性等优势，减少缺失值带来的变异度的影响，广泛用于临床和大规模研究。

PRM定量方法设置

对于PRM分析

首先我们在DDA或者DIA分析的蛋白结果里，通过PD软件筛选到响应高的蛋白特异肽段（6-25个氨基酸），肽段没有太多修饰，色谱行为佳，在摸索条件时，可以选择多个特异肽段以及母离子进行预实验，后续保留响应高，重现性好的肽段母离子，最后进行最终PRM实验。

对于PRM实验具体参数

根据情况选择不同母离子到inclusion list里，建议进行Scheduling Time设置，可以采集更多肽段数目，提升通量。PRM参数设置，list里设置待测母离子质荷比，电荷数，positive模式，start time ，end time，碰撞能量（根据DDA结果），直接通过拖拽Full scan 和PRM模块，详细参数如下图表所示。

表5.PRM参数设置（点击查看大图）

PRM数据分析

小编建议使用skyline等软件处理即可。

首先进行肽段和transition设置，导入PRM文件，当然亦可以通过DDA和DIA结果导入到软件里，筛选候选蛋白，在抽提峰时，注意峰型，同位素分布等。最后通过峰面积计算相应肽段和蛋白丰度。

PRM实验无需抗体，无需优化碰撞能量，无需子离子信息，即可获取更加准确蛋白定量结果，尤其是抗体较少的植物蛋白质定量。方法简单易设，Orbitrap作为超高分辨的检测器，可以有效的排除复杂基质带来的干扰。

赛默飞Orbitrap质谱具有高分辨率、高灵敏度和高准确度的优势，一直致力于提供领先的蛋白质组以及代谢组研究方案，提供业内最全面的定量方法，为生命科学研究提供有效的分析工具，越来越多优秀的研究成果采用了这些定量方法。

参考资料：

1.Bruderer R,et al.Extending the Limits of Quantitative Proteome Profiling with Data-Independent Acquisition and Application to Acetaminophen-Treated Three-Dimensional Liver Microtissues[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14(5):1400-1410.

2.Peterson A C, et al. Parallel Reaction Monitoring for High Resolution and High Mass Accuracy Quantitative, Targeted Proteomics[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2012, 11(11):1475.