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2. 数字分类 （1）太多的细菌表型资料，需要借助于计算机进行分析， 20世纪60年代，随计算机的应用而发展了细菌数值分类方法，这也是细菌的第一个客观的分类学方法，这也促进了细菌分类学研究的发展。 （2）数字分类的基本原则是将所有表型特征都给按“等重要原则”进行分类，不分主次，放在相同的地位上进行比较，测定其相似率，区分种群，并确定各种细菌的亲缘关系。 （3）使用相似性和距离矩阵和聚类法则，建立了等级分类，画成一个分类树，称为系统树图或者表型图。 系统树图的主要问题是不能指出种的界限。 （二）遗传学分类法 遗传学分类是在分子水平上对细菌个体的DNA、RNA和蛋白质进行研究分类的方法。 1.DNA G+C mol%含量测定 DNA分子两条链上4种碱基的总分子含量为100，测定其中G+G或A+T的分子含量，能反映出细菌间DNA分子同源程度，习惯上以G+C作为细菌分类标记。不同菌属间的G+C mol%含量范围很大，在25%~80%之间，但同一种细菌G+C mol%含量相对稳定，不受菌龄、培养条件和其他外界因素影响，亲缘关系接近的细菌，它们G+C mol/%含量相同或近似。亲缘关系疏远的细菌，它们G+C mol/%含量不同。通常认为种内菌株间G+C mol％相差不超过4~5％，属内菌株间相差不超过10~15％。目前测定的技术有加热变性法和浮力密度法。 2.DNA相似度测定 亲缘关系相近的细菌，其DNA G+C mol%含量相同或近似，但G+C mol%含量相同或近似的细菌，其亲缘关系却不一定相近。因为G+C mol%含量不能反映其碱基的序列。要比较两种细菌的核苷酸碱基对的排列顺序是否相同，相同程度如何，就要做两种细菌DNA分子相似度测定。方法是利用DNA分子杂交技术测定DNA分子的相似度。其基本步骤是先提取菌株的DNA，加热变性解链，然后将两种变性的DNA（其中一种为标记DNA）混合液在一定的温度下保温复性，重新得到杂交的双螺旋DNA分子，鉴定其双螺旋结合率。结合率的大小反映了DNA碱基序列的相似程度和菌种之间的亲缘关系的亲疏或远近。DNA-DNA杂交时，同一菌种的结合率为100%，80%~90%的同源性为同一种内、同一亚种的细菌，60%~70%的同源性为同一种内不同亚种的细菌，20%~60%同源性则认为是同一属中的不同菌种。DNA同源性分析适用于种水平的分类。1987年，国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性≥70％为细菌种的界限。 3.rRNA同源性分析 一般认为，rRNA广泛存在于各种细菌中，功能稳定，由高度保守区和可变区组成，其变化十分缓慢，是研究系统进化关系的最好材料。最初人们通过DNA-rRNA杂交和寡核苷酸编目法间接研究rRNA的同源性。DNA-rRNA杂交反映的是属与属以上水平的信息。DNA-rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不同的是① DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。 RNA 结合数是 100 mg DNA 所结合的 rRNA 的 mg 数。根据这个参数可以做出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的细菌就集中到一起。关系较远的细菌在图上占据不同的位置。 研究rRNA同源性最直接可靠的方法是rRNA核苷酸序列分析。目前，以16S rRNA序列分析的应用最为广泛。分离提取细菌16S rRNA，用T1核酸酶消化，分析寡核苷酸的碱基序列可测出rRNA的相关性。绘制各类群关系和树状图，从而确定种系的发生关系。 （三）化学分类法 化学分类是根据细菌细胞中某些特定化学物质的特征对细菌进行分类的方法，是细菌属划分的主要特征之一。目前常使用的化学分类法包括以下几种。 1.磷酸类脂分析 磷酸类脂与蛋白质、糖等共同构成细胞膜，对于物种运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。具有分类学意义的磷酸类脂是：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甲基乙醇胺(PME)、磷脂酰甘油(PG)和含有葡萄糖胺未知组分的磷酸类脂(GluNus)等五种。 2.脂肪酸组分分析 脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团在细菌中具有分类学意义。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析结果可为种和亚种分类提供有用的基本资料。 3.细胞壁成分分析 肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，它由N-乙酰葡萄糖胺（G）和N-乙酰胞壁酸（M）重复交替间隔排列，通过β-1,4糖苷键连接而成，四肽侧链连接在胞壁酸上，相邻四肽侧链之间再由 |
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