【文献快递】垂体肿瘤的MGMT的免疫组化中的争议

龙在天涯ok 2019-10-04

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《Pituitary》杂志 2019年9月30日在线发表希腊的Kontogeorgos G , Thodou E , Koutourousiou M 等撰写的临床研究《垂体肿瘤的甲基鸟嘌呤甲基转移酶免疫组化：具有临床意义的争议。MGMT immunohistochemistry in pituitary tumors: controversies with clinical implications.》（doi: 10.1007/s11102-019-00993-5.）

对于常规治疗无效的进行性进袭性（aggressive）垂体腺瘤和垂体癌患者，替莫唑胺(TMZ)目前被认为是一种合理的治疗方案。根据DNA修复酶O-6甲基鸟嘌呤DNA转移酶(MGMT)的表达，替莫唑胺(TMZ)的给药可改善许多患者的临床反应和生存。低的或阴性的MGMT免疫反应性可预测TMZ治疗的反应性。因此，MGMT可作为选择预期治疗反应的候选患者的标准。

采用多种抗原修复方案（antigen retrieval protocols），对25例Ki-67标记指数大于3%、且有p53表达的垂体腺瘤进行MGMT表达的研究。直接应用抗体后，只有一个腺瘤产生MGMT阳性。然而，在用抗原修复方案预处理组织切片后，又有3个腺瘤由最初的阴性转为阳性。

这些发现可以解释假阴性MGMT免疫组化患者对TMZ治疗缺乏反应。对肿瘤样本进行MGMT表达评估时，应谨慎使用最佳免疫组化方案，以获得一致性和可靠的结果，帮助识别可能对TMZ治疗产生反应的患者。

引言

垂体腺瘤在人口中的发生率为1/1000-2000，尽管有一部分可能需要额外的放射治疗，用现代外科手术干预和先进的药物治疗可以有效地控制。虽然大多数患者病程惰性（indolent course），一部分主要为大腺瘤，可能表现出进袭性行为，有早期的复发和进展，而约0.2%会变成真正的恶性垂体肿瘤，伴有中枢神经系统和远处的转移。

在过去二十年中在垂体腺瘤的药物治疗管理方面取得了重大进展。由于常规化疗显示的反应率低，而放射治疗则不能控制肿瘤的生长，且伴有相当大的副作用，对这些临床难治的进袭性（refractory aggressive）肿瘤的治疗仍具有挑战性。替莫唑胺(TMZ)是咪唑四嗪衍生物（imidazotetrazine derivative），抑制DNA复制的口服细胞毒性化疗药物。它最初用于治疗高度恶性胶质瘤，当用于治疗进袭性/恶性垂体肿瘤时能显著改善5年总体生存率和5年无进展生存率。这种药物目前成为对常规治疗方式没有反应的肿瘤的合理治疗选择。替莫唑胺的细胞毒活性取决于O-6甲基鸟嘌呤DNA转移酶(MGMT)的表达，这是存在于肿瘤细胞中的DNA修复酶，会导致TMZ的失活。缺乏对MGMT的免疫反应性预测对治疗有反应性。此外,在从最初MGMT表达较低的有反应的患者中移除的肿瘤中，注意到存在MGMT表达降低或呈阴性，说明TMZ也有吸收低MGMT存储的能力（capable to absorb low MGMT stores）。相比之下，肿瘤显示有高MGMT表达的患者预期没有治疗效果，提示TMZ给药应该局限于针对经选定的通过免疫组织化学评估肿瘤样本中MGMT表达期待有治疗的反应的病人。

尽管有大量的研究认为MGMT是使用TMZ治疗的患者的标志物，但其是否是TMZ治疗的最佳的预测生物标志物这仍然是一个有争议的话题。尽管最初的研究报道肿瘤的反应性与肿瘤的缺乏MGMT表达有较好的相关性，为TMZ给药治疗难治性（refractory）腺瘤提出了一个合理的方法，一部分垂体肿瘤MGMT阴性的患者对治疗无反应。对福尔马林-固定、石蜡包埋块（formalin-fixed, paraffin-embedded are available）针对MGMT的特异性单克隆抗体免疫组化。然而，阴性的结果并不总是能排除MGMT的存在。这可以用可以克服的几个技术问题来解释，例如初始免疫反应阴性的可能在对组织切片使用抗原修复协议预处理后变为阳性。因此，应该对各种协议进行仔细的测试并且标准化，以选择最适合每个病理实验室。

本项研究，试图解释在精确选择使用TMZ治疗的候选患者时，组织化学和临床争论，并突出病理学者的关键作用。

材料与方法

我们从希腊垂体肿瘤基准中心（the Hellenic Pituitary Tumor Reference Center）找到25例腺瘤，研究MGMT的表达情况。所有肿瘤均为大腺瘤，根据Ki-67标记指数(LI)升高(3 - 30%)和p53有广泛表达，以前被归类为不典型腺瘤。其中包括3例生长激素细胞腺瘤，6例泌乳素细胞腺瘤，1例混合生长激素细胞泌乳素细胞腺瘤，1例嗜酸细胞干细胞腺瘤，1例功能性促肾上腺皮质激素细胞腺瘤，1例促甲状腺激素腺瘤和12例促性腺激素腺瘤。从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取4组切片，使用培养的针对重组的MGMT蛋白(台湾台北Abnova生产，1:100稀释)的小鼠特异性单克隆抗体MT3.1，进行MGMT免疫组化检测。在4°C下过夜进行一级抗体的孵育（Incubations with primary antibody ）。简易的（one-step）(丹麦Glostrup的Dako A/S生产的)EnVision聚合物检测系统作为(密苏里州圣路易斯市Sigma公司生产 ) 氯化镍-DAB强化色素原（nickel chloride—DAB enhancing chromogen）的二级环节（secondary link）。

在第一组切片中，直接应用一级抗体。第二组切片，在室温下用1 mg/100 ml pronase E （链霉蛋白酶）(Sigma Chemical Companies, St. Louis, MO, USA)预处理20分钟。在第三组切片中,在应用一级抗体之前,部分使用抗原修复系统采用在三羟甲基氨基甲烷（Tris）/ EDTA缓冲液(pH值9.0)中加压蒸煮（pressure-cooking）20分钟。第四组切片,一级抗体被磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution）替换作为阴性对照组。内皮细胞核免疫染色为内部的阳性对照组。

结果

在第一组切片中，仅在一例29岁的男性Ki-67标记指数（ LI）为4%的稀疏颗粒型生长激素细胞腺瘤，对MGMT有局灶性免疫反应(4%)，其余为阴性(96%)。令人惊讶的是,在第二组用链霉蛋白酶预处理的切片中,生长激素细胞腺瘤显示局部MGMT表达强烈，且有广泛活性(图1)。此外,另有3例肿瘤,起初为阴性,转为阳性(图2),其中包括1例40岁的女性的Ki - 67标记指数(LI)为30%de1嗜酸干细胞腺瘤,1例60岁的男性Ki - 67标记指数(LI)为4%de1泌乳素细胞腺瘤,和1例74岁的男性Ki - 67标记指数(LI)为5%的促性腺激素腺瘤。因此，另有12%的腺瘤在酶的预处理后变为阳性。在Tris/EDTA缓冲液中进行压力蒸煮预处理的第三组切片也得到了类似的结果。作为内部对照的内皮细胞呈强阳性(图2a)。Ki-67 标记指数和p53与MGMT表达之间无相关性。

图1.a.直接应用MGMT抗体的肢端肥大症患者的稀疏颗粒型生长激素细胞腺瘤。请注意局灶性核免疫反应性(×25)。b.相同的肿瘤，显示使用链霉蛋白酶(pronase）预处理后MGMT强而广泛的免疫反应阳性(×25)。

图2.a.嗜酸干细胞腺瘤，最初对MGMT呈免疫阴性。只有内皮细胞有选择性的MGMT免疫反应性，作为内部阳性对照，确认技术的准确性(×20)。b.同一个肿瘤应用抗原修复方案变成免疫阳性。注意有局部核MGMT的表达(×20)。

讨论

本研究的结果突出了应用适当的免疫组织化学技术，以达到可靠地识别可能对TMZ治疗有反应的进袭性垂体腺瘤患者的意义。

临床医生使用的术语“进袭性肿瘤（aggressive tumors）”指的是对外科手术、药物和放射治疗有抵抗性的，侵袭性（invasive）和频繁复发的垂体腺瘤和垂体癌。在先前出版的世界卫生组织（WHO）分类中假定这些肿瘤的子集属于“不典型腺瘤”，在组织学上根据Ki-67标记指数大于3%，伴有广泛的p53核免疫染色来定义。然而，间或注意到不典型腺瘤与肿瘤进袭性之间缺乏相关性。尽管有十多年的集中研究，这一标志物的预后意义不能被证明。此外，对在进袭性肿瘤中的p53状态的含义仍存有疑问。尤其是，p53突变非常罕见，特别是可在垂体癌中发现。因此,仍然不确定p53是否是独立的预后因素。然而，肿瘤的高增殖率，在概念上与肿瘤生长有关，通常与Ki - 67升高相关。

由于有广泛的临床行为谱，尽管一些不典型腺瘤引起显著的并发症发生率，最近修订了术语。垂体腺瘤的世界卫生组织（WHO）新版中包括更新的术语和分类。考虑到Ki-67和p53的预测意义从未被确定，不推荐将这些标志物用于常规诊断。然而，Ki-67与其他参数(例如通过MRI和/或术中观察评估侵袭性)一起使用可以用来评价个体腺瘤可能更具有的临床进袭性性。根据WHO第4版s所作的改变，“不典型腺瘤”的分类已被淘汰，而引入了“高风险的（high-risk）”腺瘤。“高风险”腺瘤包括特定类型，指表现为生长快速、放射影像学上具有侵袭性(invasion)、高复发率和对常规治疗有抵抗性。这其中包括以下类型:稀疏粒型生长激素细胞腺瘤，男性泌乳素细胞腺瘤，静默性Crooke细胞腺瘤，促肾上腺皮质激素细胞腺瘤和Pit-1阳性的多激素腺瘤，以前称为静默亚型3。最近的研究表明，如果常规治疗不能控制，稀疏颗粒型生长激素细胞腺瘤呈阴性或低的MGMT表达，使用TMZ能成功治疗。此外，TMZ也有可能用于治疗高进袭性和耐药的泌乳素细胞腺瘤和垂体癌。然而,一些患者可能对TMZ治疗产生耐药性

临床病理的争议

虽然有一部分表现对MGMT低表达或表达阴性的腺瘤没有治疗反应，MGMT表达的免疫组化评价代表着选择适合接受替莫唑胺治疗的进袭性腺瘤患者的金标准。没有或低的MGMT的免疫反应性能预测TMZ治疗的反应性。然而，有些病人没有反应。这可能是由于假性低表达或假阴性的MGMT免疫组化的结果，归因于技术问题。因为MGMT的表达不一致，考虑到缺乏其他可用的治疗方式，有些临床医生忽略MGMT状态，基于高Ki-67标记指数（ LI）或p53强表达，开始使用TMZ治疗。然而，高Ki-67 标记指数或p53广泛表达并不总能预测TMZ治疗的反应。根据一些报道，MGMT免疫组化的发现与Ki-67和p53相比，并不显示与TMZ疗效有显著相关。此外,TMZ对部分甚至显示极低的Ki-67 标记指数的进袭性肿瘤患者有效。这归因于分别使用多巴胺激动剂或生长抑素类似物治疗泌乳素细胞腺瘤和生长激素细胞腺瘤等药物治疗的可能的效果。上述药物给药后会抑制细胞增殖，从而降低Ki-67水平。

技术方面的缺点

尽管有大量的研究使用MGMT作为标志物使用TMZ治疗患者，但问题在于它是否代表着对TMZ治疗有反应的最佳预测指标仍然是个辩论的主题。尽管有针对MGMT特异性抗体，适用于福尔马林固定的，石蜡包埋的组织，可用于免疫组织化学检查，有几个问题需要引起注意。缺乏MGMT与TMZ治疗反应之间的相关性研究仍存有争议，以前从未得到最终阐明。在我们的材料中，MGMT免疫组织化学直接应用，不使用任何修复方案，仅显示1例腺瘤阳性(4%)。然而,应用修复方案后，又得到另外3例最初为阴性转为阳性(共占16%)，而21例(84%)仍然是真正的阴性。这4倍增加的MGMT免疫反应意味着技术上的缺陷导致假阴性的结果。应值得注意的是，嗜酸干细胞腺瘤（the acidophil stem cell adenoma）是一个经典的进袭性高风险肿瘤，Ki-67为30%，是本研究系列中标记指数最高的，在应用抗原修复方案后转为阳性。这个范例可以解释部分进袭性肿瘤患者使用TMZ治疗效果不佳。

虽然甲醛（formaldehyde）被广泛用于组织固定，它可能会导致免疫组化应用中的技术问题。为了克服甲醛造成的抗原隐藏位点（hidden antigen sites）问题，目前存在几种预处理技术。尽管如此,抗体的稀释最佳操作应是由最终用户决定。此外,不恰当的组织固定，包括延迟或延长腺瘤组织标本在甲醛中的固定以及储存在石蜡组织块的期限也会影响技术失效。其他问题则意味着抗体的或所使用的检测系统的敏感性较低。此外,缺乏标准的评分系统或半定量的MGMT阳性核的计数以及观察者间或观察者内的变异会引起确定MGMT表达的准确水平的困难。大多数作者认为显示MGMT表达阴性或低表达的腺瘤患者是TMZ治疗的适宜治疗对象，然而，其他人认为计数低于20%的MGMT百分比可作为治疗开始的预测因素。以上提到的分析前和分析后的问题使一些推荐MGMT免疫组化检测并且只依赖升高的Ki-67的临床医生感到沮丧。