eLife│Caspase介导的IRE1裂解控制内质网应激过程中的细胞凋亡

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原创：吴鸿章（硕士三年级）

责编：付彩云（浙江理工大学 教授）

今天分享一篇2019年8月发表在eLife上的文章。“Caspase-mediated cleavage of IRE1 controls apoptotic cellcommitment during endoplasmic reticulum stress”，通讯作者为美国Genentech的Avi Ashkenazi，第一作者为同单位Anna Shemorry。

背景

内质网(ER)介导新合成的蛋白质的三维折叠，在内质网中蛋白质组装的过度需求导致了未折叠蛋白质的积累，从而引起了内质网应激(ER stress)反应。未折叠蛋白反应(UPR)是一种细胞内传感-信号网络，它检测内质网应激并协调内质网适应以重建细胞内稳态。UPR驱动ER的物理和生化扩展，同时暂时减轻蛋白质翻译负荷，并通过ER相关降解(ERAD)促进未折叠蛋白质的清理。在后生动物细胞中，UPR由三种跨膜蛋白组成：肌醇需要酶1(IRE1)，蛋白激酶R样激酶(PERK)和激活转录因子6(ATF6)，这些蛋白质通过它们的内质网腔域和跨膜域直接或间接地检测内质网应激，它们将信号转导到细胞质和细胞核，以促进细胞适应环境的变化。BiP/GRP78在UPR激活过程中起了重要作用。

IRE1a是进化上最保守的UPR传感器，在酵母、苍蝇、蠕虫、鱼类和灵长类动物中显示出结构和功能的同源性。PERK含有类似的管腔结构域和细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶模块，但缺少RNase部分。在内质网应激情况下，PERK磷酸化真核翻译起始因子a(EIF2a)，诱导了激活转录因子4(ATF4)的表达。反过来，ATF4刺激许多支持内质网适应的基因，包括编码转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的基因。真核生物UPR的主要功能是使ER适应蛋白质折叠需求的动态变化。然而当在ER-应激缓解失败的情况下，则触发细胞凋亡途径的发生，细胞凋亡的核心细胞内凋亡机制需要一个依赖半胱氨酸，天冬氨酸特异性caspases蛋白酶家族。但目前关于caspase机制是否对UPR施加反向控制的研究仍然很少。本文作者揭示了凋亡的caspases和UPR之间的一种新的交叉调节机制，该机制调节细胞在内质网应激期间的细胞存活。

这项研究结果表明，在造血细胞中，包括多发性骨髓瘤(MM)，淋巴瘤和白血病细胞系，ER应激导致caspase介导的关键UPR传感器IRE1在其细胞质连接器区内的切割，产生一个稳定的跨膜片段(LDTM)。这种裂解减弱了其在内质网扰动下的激活，且LDTM通过抑制关键促凋亡蛋白Bax向线粒体的募集而对凋亡信号施加负反馈。此外，异位LDTM表达促进小鼠多发性骨髓瘤的生长。

结果

1. 内质网应激促进caspase介导的IRE1切割

作者纯化了重组人IRE1LD蛋白，并分离出小鼠IgG2a单克隆抗体，该单克隆抗体选择性地识别LD内的特定表位(抗IRE1aLD)。选择KMS11和OPM2两个MM细胞系，在内质网应激诱导剂毒胡萝卜内酯（thapsigargin，TG），衣霉素（tunicamycin，TM），布雷菲德菌素A （brefeldinA，BfeA）和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT），细菌毒素枯草杆菌AB5(SubAB)刺激下，用抗IRE1LD抗体进行WB分析显示，不仅存在全长~105kDa的IRE1蛋白，而且在ER胁迫下出现了额外的~55kDa条带(图1B和C)，表明形成了N-末端含有LD的IRE1片段。与抗IRE1aCD抗体的平行分析也显示全长IRE1蛋白，以及响应内质网应激而形成的一条或多条约50kDa的额外条带(图1B和C)，用caspase抑制剂zVAD处理KMS11或OPM2细胞在内质网应激时阻止含有LD和Cd的IRE1片段的产生。作者构建了天冬氨酸507或512突变体，测试caspase介导的切割，发现并不能阻止IRE1对ER应激的反应，但这两个残基同时突变阻止了大部分的切割(图1F)。即使在双突变的情况下，抗IRE1aLD抗体也可以检测到一些残留的条带，这表明切割可以转移到效率较低的替代位点。作者进一步通过CRISPR/Cas9技术敲除了KMS11细胞中的Bax基因。与WT细胞相比，这些克隆结果显示检测不到的IRE1片段 (图1G)。作者发现包括NCI-H441(非小细胞肺癌)，JHH-1(肝细胞癌)和A2058(黑色素瘤)，并没有类似的现象。因此，ER应激诱导的caspase介导的IRE1切割更容易发生在造血细胞中，包括恶性和非恶性类型。类似的过程也发生在小鼠原代骨髓来源的树突状细胞(BMDC)中，在未处理时已经显示出一些IRE1裂解(图1H)。

图1 内质网应激在胞质连接区诱导了caspase介导的IRE1切割。

2. IRE1的主要片段在细胞内的分布不同

作者为了研究这些产物的细胞持久性，跟踪了它们在8小时内经历TG诱导的内质网应激的细胞中的水平。在OPM2和KMS11细胞中，在加入TG后的8小时内LDTM片段丰度增加，而CD片段在前4小时积累，然后下降(图2B和C)。在这段内质网应激期间，全长IRE1蛋白的量显著减少，而zVAD抑制剂处理后阻止了这种下降，保留了大部分最初的全长IRE1蛋白(图2B和C)。因此，在没有从头蛋白质合成的情况下，caspases可以切割许多可用的IRE1细胞池以响应内质网应激。因此，caspase介导的IRE1裂解抑制了ER应激对IRE1的激活，表明凋亡的级联反馈到IRE1上以降低其细胞保护活性。

图2 IRE1的LD和CD片段在各细胞组分中的分布不同。

3. LDTM减弱了凋亡caspase的激活

作者发现IRE1的LDTM片段比CD片段持续的时间更长。因此作者转向研究LDTM是否执行某些特定的细胞功能。稳定转染LDTM进入KMS11细胞系。研究发现与未转染的KMS11细胞相比，异位LDTM表达提高了KMS11细胞的活力，降低了caspase-3/7的活性(图3A和B)，表明细胞凋亡减弱。此外，与共转染的KMS11细胞类似，在TG或SubAB诱导ER应激时，过表达LDTM的单细胞衍生克隆也显示出与亲本细胞相比caspase-3/7活性降低(图3C)。作者进一步从机制上研究LDTM如何抑制caspase激活，首先研究其抗凋亡活性是否需要全长IRE1的存在。为了验证这一点，作者改造了KMS11细胞，构建了针对IRE1mRNA的3’UTR的可诱导shRNA表达稳转细胞系。随后用编码Flag标记的LDTMcDNA的质粒转染这些细胞，以抵抗IRE1 shRNA。结果发现，亲本细胞(含有shRNA而不是LDTM结构)表达了自体全长IRE1，并在用TG处理时产生了相应的LDTM产物(图3D)。此外，这些亲本细胞在用多西环素(DOX)诱导shRNA时显示全长IRE1蛋白完全耗尽，这阻止了TG诱导的内源性LDTM片段的产生，LDTM转染细胞在所有条件下都表达异位LDTM蛋白。在DOX处理后，这些细胞同样显示内源性全长IRE1及其LDTM产物的完全耗尽。重要的是，无论DOX处理如何，表达异位LDTM的细胞在TG或TM诱导的ER应激下显示出更高的存活率和减少的caspase-3/7激活(图3D和E)。这些数据表明，在存在或不存在内源性IRE1的情况下，LDTM对细胞凋亡的衰减同样有效。因此，LDTM抑制凋亡的caspase激活独立于全长IRE1。

图3 异位表达IRE1 LDTM减弱了凋亡caspase的激活，该作用与全长的IRE1无关。

4. LDTM抑制了关键的线粒体凋亡事件

为了进一步确定LDTM如何减弱caspase激活，作者发现与亲本对照相比，LDTM转染的KMS11克隆显示出大约1.5倍的Bax表达升高(图4A)，可能反映了对LDTM提供的细胞保护的一种代偿性上调。然而，异位LDTM表达减弱了内质网应激时，线粒体Bax的相对增加和胞质Bax的协调下降(图4A)。与其减少线粒体募集Bax的能力一致，LDTM表达也抑制了在对SubAB或TG作出反应的ER应激下的细胞线粒体去极化(图4B)。此外，LDTM减弱线粒体对钙的摄取-一种特征性的凋亡事件，Bax敲降细胞株也同样减少(图4C)。LDTM还减弱了TG诱导的线粒体细胞色素C水平的下降和胞质细胞色素C的相应增加(图4D)。此外，LDTM减弱TG诱导的caspase-9的激活(图4E)，据报道caspase-9在胞质中诱发通过细胞色素C诱导的凋亡小体组装以及下游的caspase-3/7激活事件。综上所述，这些结果表明LDTM通过调控BAX募集到线粒体消弱了凋亡caspase的激活，从而阻断凋亡级联反应，如MOMP，线粒体钙摄取，细胞色素C释放到细胞质中，以及caspase-9和caspase-3/7的激活。

图4 LDTM消弱了重要的线粒体凋亡事件。

5. 异位LDTM表达促进多发性骨髓瘤进展

为了确定LDTM的抗凋亡作用是否有生物学意义，作者们在体外和体内研究了LDTM对多发性骨髓瘤细胞生长的影响。使用Incucyte S3仪器进行了数天的汇合度分析发现异位LDTM表达增强了限制在基质上的KMS11细胞的增殖 (图5A)。进一步进行动物水平研究，将细胞移植到SCID小鼠的皮下。发现异位LDTM表达显著促进体内KMS11肿瘤移植瘤的生长(图5B)。Bax敲降克隆株也促进KMS11肿瘤移植瘤的生长(图5C)。此外，虽然使用shRNA技术缺失IRE1在体外和体内都抑制了KMS11细胞的生长，但LDTM的表达即使在IRE1敲除的情况下也会加速生长(图5A和B)，这与LDTM提高细胞活力的能力是一致的，而不依赖于全长IRE1。值得注意的是，KMS11肿瘤组成性地产生了内源性LDTM片段，表明肿瘤微环境中的细胞应力驱动caspase介导的IRE1切割。综上所述，这些结果表明，由异位LDTM建模的caspase介导的IRE1裂解的N末端产物对KMS11细胞产生了足够的生物学影响，从而增强了它们在体外和体内生长受限条件下增殖的适应性。

图5 LDTM增强了多发性骨髓瘤进展。

结论

造血细胞中，ER应激导致caspase介导的关键UPR传感器IRE1在其细胞质连接区的切割，产生一个稳定的IRE1片段 LDTM。LDTM通过抑制关键促凋亡蛋白Bax向线粒体的募集而对凋亡信号施加负反馈，揭示了凋亡的caspase机制和UPR之间的特别的交叉调节机制，Caspase介导的IRE1裂解产生的LDTM可以显著改善癌细胞在应激微环境中生存和生长的适合性。这一结论对于IRE1在造血系统恶性肿瘤中的作用具有重要的潜在意义。因为它表明IRE1不仅在作为细胞保护性UPR介体的一般作用中促进肿瘤生长，特别是通过其caspase驱动的抗凋亡LDTM产品。